Анализ фотодинамики белковых комплексов тилакоидных мембран при помощи масс-спектрометрии высокого разрешения

• Автор: Галецкий, Дмитрий Николаевич
• Шифр специальности: 02.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 135 с. : ил.

Содержание
Введение.

Глава 1. Исследуемые объекты и методы их анализа

1.1. Пигментнобелковые комплексы тнлакондных мембран хлоропластов

1.1.1. Структура тнлакондных мембран.

1.1.2. Фотосистемы 1 и II.

1.1.3. Светособирающие комплексы

1.2. Световой стресс и адаптация к нему тклакоидов.

1.2.1. Световой стресс и фотоингибирование

1.2.2. Механизмы защиты от светового стресса

1.2.3. Фотодинамика фосфорилирования белков фотосистем

1.2.4. Протеомный анализ фотодинамики тилакоидных комплексов
1.3. Массспсктрометрия высокого разрешения в протеомном анализе.
1.3.1. Роль массспектромстрии в анализе протеомов
1.3.2. Разрешающая способность и точность измерения масс
1.3.3. Массспектрометрня ИЦР ПФ
1.3.4. Анализ модифицированных белков.
Глава 2. Анализ белков светособирающнх комплексов.
2.1. Методика проведении эксперимента.
2.1.1. Создание светового стресса.
2.1.2. Фракционирование тилакоидных мембран и извлечение светособирающих комплексов
2.1.3. Использование методов гельэлектрофореза для разделения белков.
2.1 Л. Массспектрометрический анализ и идентификация белков
2.2. Идентификация белков, разделнных двумерным гельэлектрофорезом.
2.2.1. римененис ионизации методом электроспрсй.
2.2.2. Массспектрометрический анализ с использованием метода ионизации МА1Л1
2.2.3. Изменения в белковом составе антенны но данным двумерного гельэлекгрофореза.
2.3. Анализ белков после одномерного гельэлектрофореза.
2.3.1. Идентификации сложных белковых композиций
2.3.2. Сравнительный анализ белков в композиции.
2.3.3. Обзор вызванных световым стрессом изменений в светособирающих комплексах.
Глава 3. Фотодинамика протеома тилакоидных мембран
3.1. Протсомный анализ тилакоидных мембран
3.1.1. Оптимизация методов пробоподготовкн и разделения.
3.1.2. Хроматомассснектрометрический анализ.
3.1.3. Редкие и светоиндуцированные белки.
3.2. Фотодннампка фосфорнлнровании хлорофиллевнзывающих белков.
3.2.1. Идентификация фосфорнлироваииых белков.
3.2.2. Фотодинамика фосфорилирования белков фотосистемы II
3.3. Нитрирование и другие фотоокпелительпые модификации
3.3.1. Iйгтрированис
3.3.2. Окислительные модификации триптофана.
3.3.3. Фотодинамика нитрирования тирозина и окисления триптофана
Глава 4. Реорганизации фотосинтезирующих комплексов.
4.1. Разделение и анализ пигментнобелковых комплексов
4.1.1. Общая стратегия эксперимента.
4.1.2. Особенности хроматомассспектрометрического анализа и идентификации белков
4.2. Редкие хдорофнллсвизывающне белки в структуре фотосистем
4.2.1. Состав пигментнобелковых комплексов.
4.2.2. Локализация редких хлорофиллсвязывающих белков
4.2.3. Диссоциация комплексов фотосистем
4.2.4. Общая характеристика фотодннамических процессов в фотосистемах.
4.3. Роль фосфорилирования и мигрировании в реорганизации комплексов
4.3.1. Уровни регуляции фотофосфорилирования в комплексах фотосистемы II
4.3.2. Роль нитрирования в распаде фотосинтезирующих комплексов.
4.3.3. Взаимное влияние фосфорилирования и нитрирования.
Заключение.
Выводы.
Список литературы


Сравнительный анализ проведн с использованием абсолютных значений интенсивности сигналов идентифицированных пептидов в образцах до и после светового стресса. По результатам анализа описан ряд процессов, связанных с адаптацией к интенсивности света. Третья глава посвящена протеомному анализу белков тилакоидных мембран. Предложенная методика состояла из одномерного гельэлектрофореза белков и последующего хроматомассспсктрометричсского анализа продуктов их протсолиза трипсином. Анализ пептидов включал в себя разделение с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, определения их молекулярной массы в ячейке ИЦР, фрагментацию ионов выбранных пептидов в линейной квадрунольной ловушке с последующим установлением их аминокислотной последовательности. Разработанная методика применена для анализа редких и модифицированных белков. Выявлены свстозависимые белки и модификации. В чегвртой главе описывается методика разделения и анализа фотосинтезирующих комплексов тилакоидов, состоящая из iv гельэлсктрофорсза и хроматомассспектрометрии. Анализ пигментнобелковых комплексов был основан на построении профилей распределения входящих в их состав белков на основе хроматомассспектров высокого разрешения. С помощью разработанной методики проведено комплексное исследование функциональных особенностей редких хлорофиллсвязывающих белков, а также роли нитрирования и фосфорилирования белков в фотоингибировании и ремонтном цикле фотосистемы II. Глава 1. Важнейший для всего живого процесс поглощения и преобразования энергии света в химическую энергию органических веществ, фотосинтез, осуществляется в мембранах хлоропластов и представляет собой сложную систему фотофизических, фагохимических и химических реакций. Тилакоидпые мембраны хлоропластов представляют собой высокоорганизованную и структурированную систему, включающую в себя совокупность взаимодействующих друг с другом пигментнобелковых комплексов, интегрированных в липидной мембране 2, компоненты электротранспортной цени и биохимического синтеза углеводов 3. Структурным компонентом внутренних мембран хлоропластов является тилакоидная мембранная система, окружнная внутренней гомогенной средой, стромой. Тилакоидная мембрана включает в себя структурированные дисковые участки, называемые граной. Внутреннее пространство тилакоидной мембраны образует люмен. В мембранах тилакоидов локализованы пигменты и другие компоненты, связанные с поглощением и использованием энергии света. Биохимические системы синтеза и превращения углеводов функционируют в строме хлоропластов. В состав тилакоидных мембран хлоропластов входят четыре многокомпонентных белковых комплекса см. II II, в которой происходит катализируемый светом процесс разложения воды с образованием протонов, электронов и молекулярного кислорода 4. Образующиеся электроны покидают II в виде протонированной восстановленной формы пластохиноЕШ . I I, участвующая в переносе электронов с пластоцианина на фсррсдоксин 5 и преобразующая энергию восстановления в часть прогонного градиента для синтеза А ГР. АТРазный комплекс , осуществляющий фосфорилирование с образованием АТР, используя протонный градиент 7. Каждая фотосистема состоит из собственно реакционного центра и ассоциированных вокруг него светособирающих или антенных комплексов , ivi x 5, 8. Состав и структура реакционных центров осталась практически неизменной за время эволюции от цианобактерий и зелных водорослей до высших растений II. Пространственная ориентация компонентов электронной цепи, их взаимодействие с антенной и с восстановительным комплексом ферредоксина и ферредоксин оксидорсдуктазы осуществляется фотосистемой I, состоящей из структурных единиц, названных от до . Фотосистема I использует в качестве донора электронов медьсодержащий водорастворимый белок иластоцианин. Элементами электротранспортной цепи являются первичный донор электронов Р0 гетеродимер хлорофиллов а и а, два первичных акцептора электронов Ао мономеры хлорофиллов а, две молекулы филлохинона i и зри . Конечным акцептором электронов является водорастворимый белок фсррсдоксин.