Пероксидаза в полиэлектролитном комплексе и мицеллах поверхностно-активных веществ для определения ее субстратов и эффекторов в водно-органических средах

• Автор: Кирейко, Антонина Викторовна
• Шифр специальности: 02.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 213 с. : ил.

1.1. Иммобилизация фермента путем его включения в молиэлектро литный комплекс

1.2. Иммобилизация ферментов по тех пологим послойного нанесения пленок ферментполиэлектролит

1.3. Применение полиэлектролитных пленок для создания биосенсо ров

Глава 2. Свойства и применение ферментов, модифицированных

поверхностноактивными веществами и солюбилизованных в обращенных мицеллах

2.1. Каталитическая активность и стабильность ферментов, содюби лизованных в обращенных мицеллах ПАВ
2.2. Применение комплексов фермснтПАВ в качестве катализаторов в неполярных органических растворителях

2.3. Биосепсоры на основе солюбилизованных ферментов

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 3. Исходные вещества, посуда, аппаратура, обработка результа

тов измерений, методика эксперимента

3.1. Исходные вещества
3.2. Посуда, аппаратура
3.3. Методики эксперимента
3.4. Обработка результатов измерений
Глава 4. Включение псроксидазы в полиэлектролитный комплекс с хитозаном как средство повышения активности и стабильности фермента в водной и водноорганической средах
4.1. Обоснование выбора полиэлектролита для образования
комплекса с пероксидазой
4.2. Получение полиэлсктролитиого комплекса пероксидазахитозан
4.2.1. Обоснование выбора индикаторной реакции для контроля
активности псроксидазы в прису тствии хитозана
4.2.2. Влияние хитозана на скорость реакции окисления о
дианизидииа пероксидом водорода
4.2.3. Выбор оптимальных концентраций компонентов индикаторной реакции, катализируемой полиэлектролитным комплексом псроксидаза хитозан
4.2.4. Влияние природы, и концентрации буферного раствора на активность полиэлсктролитиого комплекса пероксидазахитозан
4.3. Изучение кинетики реакции окисления одианизидипа
пероксидом водорода, катализируемой полиэлектролитным комплексом псроксидаза хитозан
4.4. Влияние диметилсульфоксида на каталитическую активность и 5 стабильность полиэлсктролитиого комплекса пероксидазахитозан
Глава 5. Пероксидазное окисление фенотиазипов в водноорганнчес
ких средах
5.1. Ферментативное определение фенотиазипов по их пероксидаз 3 пому окислению в водных растворах и в присутствии ДМСО
5.2. Определение фенотиазипов в водных растворах и в присутствии 4 ДМСО по их влиянию на скорость окисления оД пероксидом водорода, катализируемого полиэлектролитным комплексом перокси
даза хитозан
5.3. Определение промазина в плазме крови
Глава 6. Аналитические возможности применения псроксидазы в
средах прямых и обращенных мицелл ПАВ
6.1. Обоснование выбора поверхностноактивных веществ
6.2. Изучение механизма индикаторных реакций пероксидазного
окисления одианизидина, 3,,5 тетраметилбензидипа и офенилеидиамина в средах прямых мицелл ДДС и ДОТ
6.3. Оптимизация условий проведения индикаторной реакции 8 псроксидазного окисления одианизидина в средах обращенных мицелл ДО Г и ДДС
6.4. Изучение реакций окисления оД пероксидом водорода и органи 4 ческими пероксидами, катализируемых пероксидазой в средах прямых и обращенных мицелл ПДВ
6.5. Влияние второго субстратавосстановителя и эффекторов на 1 каталитическую активность иероксидазы в среде обращенных мицелл ПАВ
6.5.1. Влияние цнетеина на каталитическую активность 2 нсроксидазы в водном растворе и в среде обращенных мицелл ПДВ
6.5.2. Влияние сульфаниламида на каталитическую активность 6 нсроксидазы в водном растворе и в среде обращенных мицелл ПАВ
6.5.3. Влияние имидазола на каталитическую активность перок 8 сидазы в водном растворе и в среде обращенных мицелл ПДВ
6.6. Ферментативное определение сульфаниламида, цистеина и 3 имидазола в водном растворе и в средах прямых и обращенных мицелл ДДС
6.7. Определение пероксида водорода и органических пероксидов в 5 водном растворе и в средах прямых и обращенных мицелл ПАВ
6.8. Определение органических пероксидов в оливковом масле
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ


Показано, что в подноспиртовой среде при содержании этанола ахимотрипсин полностью теряет свою каталитическую активность вследствие денатурации и агрегации . Образование комплекса фермента с полиэлскгролитом например, иолиметакриловой кислотой приводит, вопервых, к повышению каталитической активности фермента в 2 3 раза при содержании спирта , а, вовторых, к расширению диапазона содержания спирта до , при котором фермент сохраняет каталитическую активность. Таким образом, анализ литературных данных показывает, что образование комплекса ферментполиэлсктролит приводит к стабилизации фермента при хранении, как в водном растворе, так и в органических средах, к увеличению тсрмостабильности. Биосспсоры, в состав которых входят нолиэлектролитные комплексы ферментов, обладают лучшими аналитическими характеристиками. Технология получения пленок, предложенная Деккером в х годах, заключается в послойном нанесении полиэлектролитных соединений противоположного заряда на некую поверхность гидрофобную или гидрофильную стекло, силикон, кварц, металл и др. Пленки могут быть нанесены на микрочастицы коллоидной суспензии латексные сферические частицы, неорганические кристаллы или липидные капли размером в несколько микрон. В этом случае послойное нанесение полимеров осуществляют по аналогичной методике в суспензию коллоидных частиц добавляют раствор, например, поликатиона, и через некоторое время, когда процесс сорбции полиэлектролита завершен, свободные молекулы поликатиона отделяют от коллоидных частиц. Таким же образом наносят слой полианиоиов. С использованием предложенной технологии можно добиться нанесения любого числа полиэлектролитных слоев. В работе па примере получения по технологии ПНП иммобилизованных препаратов урсазы и лакказы, наносимых последовательно с раствором поликатиона пол и диметил диаллиламмоний хлорида ПДДА на поверхность целлюлозы, установлено, что их активность линейно возрастает с увеличением числа г бислосв фермептполиэлектролит г I 3. Такая классическая для технологии ПНП зависимость указывает на равномерную адсорбцию фермента в слоях и на отсутствие диффузионных препятствий для подхода субстрата к ферменту. Таким образом, одно из преимуществ послойного нанесения фермента на поверхность заключается в возможности регулирования активности иммобилизованного биокатализатора путем правильного выбора числа слоев ферментполиэлектролит и, следовательно, количества иммобилизованного фермента. Несомненным достоинством послойной электростатической иммобилизации биокатализатора является значительное повышение стабильности фермента при хранении. Это достигается за счет образования полиэлектролитом защитного микроокружения вокруг фермента. Так, иммобилизованные лакказа и уреаза сохраняли начальной активности через дней при хранении препаратов в водном растворе при 4С . При этом основная потеря каталитической активности ферментов наблюдалась в первые дней . Авторы полагают, что это связано с десорбцией фермента с подложки. Одним из способов предотвращения десорбции иммобилизованного фермента в процессе хранения является нанесение на слой фермента защитного слоя полиэлектролита с зарядом, разноименным с зарядом фермента. Несмотря на то, что вследствие экранирования фермента начальная активность такого препарата меньше , предложенный прием позволяет предотвратить десорбцию фермента, и через дней храпения биокатализатор проявляет от первоначальной активности. В работе при иммобилизации 5 слоев органофосфорогидролазы и полиэтилеиимина на стеклянных шариках с мкм было установлено, что стабильность иммобилизованного фермента при хранении сильно зависит от природы верхнего слоя. Для стабилизации иммобилизованного препарата его покрывали дополнительным слоем синтетического полиэлектролита. Иммобилизованный препарат сохранял каталитическую активность в течение 6 мсс при 4С. В противном случае без внешнего дополнительного покрытия биокатализатор полностью терял каталитическую активность через 2,5 дня. Защитный слой предотвращал дезактивацию и десорбцию фермента при увеличении ионной силы раствора .