Разработка микрометодов анализа аминокислот, коротких пептидов и олигонуклеотидов с использованием ОФ ВЭЖХ и капиллярного электрофореза

• Автор: Мельников, Игорь Олегович
• Шифр специальности: 02.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 147 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. аАминокислоты и методы их анализа.

1.1.1. Общие положения.

1.1.2. Методы анализа

1.1.3. Способы детектирования

1.2. Низкомолекулярные аминотиолы плазмы крови и методы их анализа .

1.2.1. Гомоцистеин и его метаболизм в организме человека

1.2.2. Методы анализа гомоцистеина.

1.2.3. Способы идентификации гомоцистеина 1.2.3Л. Методы, не требующие предварительной

дериватизации.

1.2.3.2. Методы с предварительной дериватизацией
1.3. Методы разделения и идентификации полинуклеотидов
1.3.1. Нуклеиновые кислоты. Общие положения
1.3.2. Дезоксирибонуклеиновые кислоты. Методы анализа
1.3.3. Капиллярный гельэлектрофорез. Основы метода.
Область применения .
1.3.4. Определение мутаций генов.
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
2.1. Реактивы и материалы.
2.2. Приготовление рабочих растворов
2.3. Приборы и оборудование .
2.4. Общая методология работы.
2.4.1. Анализ свободных генетически кодируемых аминокислот методом капиллярного электрофореза
2.4.2. Анализ гомоцистеина, цистеина и глутатиона
методами ОФ ВЭЖХ и капиллярного электрофореза
2.4.3. Анализ олигонуклеотидов методом капиллярного гельэлектрофореза.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Определение свободных кодируемых аминокислот
3.1.1. Определение методом капиллярного зонального электрофореза
3.1.2. Определение методом мицеллярной электрокинетической хроматографии
3.2. Определение гомоцистеина и других низкомолекулярных аминотилов плазмы крови
3.2.1. Определение микроколоночной ОФ ВЭЖХ
3.2.2. Определение методом капиллярного электрофореза
3.3. Определение мутаций в молекулах ДНК
методом капиллярного гельэлектрофореза
4. ВЫВОДЫ.
5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
АИОХ анионообменная хроматография
АК аминокислота
АТ аминотиолы
АХ аффинная хроматография
ГХ газовая хроматография
ДЦСН додецилсульфат натрия
ДМСО диметилсульфоксид
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
ДНС 2диметиламино5сульфонил, дансил
ДЭА диэтаноламин
ИОХ ионообменная хроматография
ИПХ ионпарная хроматография
ИФА иммуноферментный анализ
КГЭ капиллярный гельэлектрофорез
КЗЭ капиллярный зональный электрофорез
КЭ капиллярный электрофорез
ЛИФ лазерноиндуцированная флуоресценция
МС массспектрометический
МЧ микрочип
МЭКХ мицеллярная электрокинетическая хроматография НК нуклеиновые кислоты
ОФ ВЭЖХ обращенофазовая высокоэффективная хроматография
ПАА полиакриламид
ПГЭ плоскостной гельэлектрофорез
пДМА полиЫ,диметилакриламид
ПЦР полимеразная цепная реакция
ПЭГ полиэтиленгликоль
ССК 5сульфосалициловая кислота
ТБДМС третбутилдиметилсилил
ТБФ тринбутилфосфин
ТМС триметилсилил
ТНФ тринитрофенил
ТСХ тонкослойная хроматография
ТФФ трифенилфосфин
УФ ультрафиолетовый
ФИТЦ фенилизотиоцианат
ФЛ флуоресцентный
ФТГ 2фен ил3тиогидантоин
ФТК фенилтиокарбамоил
ЭДГТ электрофорез в денатурирующем геле
ЭОП электроосмотический поток
ЭХ электрохимический
4аминосульфонил7фтор2,1,3бензоксадиазол ацетамидофлуоресцеин
3циклогексиламино1пропансульфоновая кислота
цистеин
дитиоэритреитол
дитиотреитол
I электронная ионизация
I ионизация электрораспылением
флуоресцеинмапеимид
глутатион
Нсу гомоцистеин
5I 5иодоацетамидофлуоресцеин
6I 6иодоацетамидофлуоресцеин I ионизация лазерной десорбцией монобиман
шВгВ монобромобиман, 4бромметил3,6,7триметил1,5диазабицикло 3.3.0октадиендион этилмалеимид 1 пиренилмалеимид ОРА офталевый диальдегид 7фторо2,1,3бензоксадиазол4сульфонат
Мтрисгидроксиметилметил3аминопропансульфоновая кислота общий уровень содержания гомоцистеина I трисгидроксиметиламинометан
ВВЕДЕНИЕ


Результаты проведенной работы использованы при создании и апробировании в практике биомедицинского анализа универсального экономичного автоматизированного комплекса приборов и методов молекулярной диагностики некоторых социальнозначимых заболеваний инфаркты, инсульты, тромбозы, разрабатываемого в институте аналитического приборостроения РАН. КПдиметилакриламиде. Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на 8м Всероссийском симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматографии и капиллярному электрофорезу октября г. Москва, Россия, 3м Международном симпозиуме по методам разделения в бионауках мая г. Москва, Россия,, Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам Ломоносов Секция химия. Москва, Россия, 2ой научнопрактической конференции Актуальные проблемы медицинской биотехнологии сентября г. Анапа, Россия, 3м съезде общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова октября г. Москва, Россия, 1ой конференции молодых ученых МИТХТ им. М.В. Ломоносова октября г. Москва, Россия, Международном конгрессе по аналитическим наукам 1САБ июня г. Москва, Россия, м Международном конгрессе федерации европейских биохимических обществ июня г. Стамбул, Турция, м Международном симпозиуме по разделению белков, пептидов и полинуклеотидов октября г. Инсбрук, Австрия. Публикации. По материалам диссертации опубликовано работ в виде статей и тезисов докладов. Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Материал диссертации изложен на 7 страницах, содержит таблиц и рисунка. Список литературных источников состоит из 7 наименований. Аминокислоты АК представляют собой полифункциональные соединения. В зависимости от положения аминогруппы относительно карбоксильной их разделяют на а, р, и уаминокислоты. Наиболее широкое распространение в природе имеют ааминокислоты. По природе радикала аминокислоты разделяют на алифатические, ароматические и гетероциклические 1. АК имеют цвиттерионную структуру, т. Форма существования АК в растворе определяется значением . При , равных изоэлектрической точке р1, основной формой является цвиттерион, который ведт себя как неэлектролит. Изменяя значение раствора, можно добиться того, что аминокислота будет присутствовать в растворе либо в катионной, либо в анионной форме рис. В настоящее время известно генетически кодируемых АК, включая селеноцистеин 2,3 и пирролизин 4. В табл. АК, их изоэлектрические точки и значения рКа карбоксильных и аминогрупп. Все АК, кроме глицина, имеют ассиметричный атом углерода и, как следствие, обладают оптической изомерией. В природе в основном встречаются АК Ьряда 1,5. НзЫС
Рис. Аминокислоты являются структурными единицами при синтезе белка в организме. Последовательность АК в синтетическом белке определяется нуклеотидной последовательностью ДНК. Следует отметить, что в организме также присутствуют АК, образующиеся в процессе метаболизма ряда соединений. Некоторые заболевания, как например, болезнь Альцгеймера 6, ишемический инсульт 7, фенилкетонурия 8, почечная недостаточность 9 и др. АК в различных биологических жидкостях кровь, моча и т. В настоящее время основными методами анализа АК являются хроматографические методы. Наиболее широко применяются ионообменная и высокоэффективная жидкостная хроматография . Реже используются тонкослойная хроматография , газовая хроматография ,, и капиллярный электрофорез . Каждый из этих методов анализа имеет свои преимущества и недостатки. Исторически первым методом анализа АК является тонкослойная хроматография ТСХ. В ней, как правило, для идентификации аминокислот используют денситометрическое детектирование. В настоящее время этот метод представляет собой альтернативу методу ВЭЖХ. Уступая ВЭЖХ по чувствительности, точности и воспроизводимости Бг 0,1 он значительно превосходит ее по простоте выполнения, доступности оборудования и расходных материалов . ТСХ часто используют для полуколичественного определения АК. Известны методы разделения свободных АК и их 2диметиламино5сульфонил ДНС производных Рис. ТСХ . Одномерная ТСХ позволяет анализировать около десяти образцов АК одновременно , в то время как двумерная до и на более коротком расстоянии проявления стандартная пластина размером x см.