Эффекты гипоксии и глюкокортикоидов на программируемую гибель клеток неонатального мозга

• Автор: Ланшаков, Дмитрий Александрович
• Шифр специальности: 03.03.01
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 139 с. : ил.

Оглавление
Оглавление

Список сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Глюкокортикоиды и их влияние на развитие организма

1.1.1 Рецепторы глюкокортикоидов

1.1.2 Экспрессия глюкокортикоидных рецепторов в головном мозге

1.1.3 Генетические модели для изучения функции глюкокортикоидных рецепторов

1.1.4 Влияние глюкокортикоидов на развитие головного мозга

1.2 Апоптоз и его роль в развитии организма

1.3 Особенности некроза, аутофагии и апоптоза
1.3.1 Некроз
1.3.2 Аутофагия
1.3.3 Апоптоз
1.3.4 Молекулярные механизмы апоптоза
1.3.5 Основные пути запуска апоптоза
1.3.6 Апоптоз в развивающейся ЦНС
1.3.7Участие каспазы-3 и ВНЗ белков в синаптической пластичности
1.3.8 Другие формы клеточной гибели
1.4 Клеточная гибель в результате эксайтотоксичности
1.4.1 Рецепторы глутамата
1.4.2 Смешанные формы клеточной гибели при эксайтотоксичности
1.4.3 Роль внутриклеточного баланса ионов в механизме эксайтотоксичной гибели клеток
1.4.4 Роль митохондрий в эксайтотоксической гибели клеток
1.4.5 Эндоплазматический ретикулум и эксайтотоксичность
1.4.6 Роль лизосом в эксайтотоксической гибели клеток
1.5 Влияние глюкокортикоидов на апоптоз
1.6 Гипоксия и глюкокортикоиды
1.6.1 Транскрипционные факторы индуцируемые гипоксией HIF
1.6.2 Гипоксия и глюкокортикоиды
Глава 2. Материалы и методы
2.1 Экспериментальные животные
2.2 Введение препаратов и воздействие гипоксией
2.3 Выделение образцов ткани мозга и приготовление его срезов для гистологического анализа
2.4 Окраска по Нисслю
2.5 Иммуногистохимическое окрашивание срезов головного мозга

2.6ТиИЕІ.-метод
2.8 Микроскопия
2.7 Выделение РНК
2.8 Оценка уровня мРНК каспазы-3 и с^об методом ПЦР-РВ
2.9 Иммуноблот
2.10 Статистическая обработка результатов
Глава 3. Результаты
3.1 Экспрессия глюкокортикоидных рецепторов в мозге неонатальных крысят
3.2 Влияние дексаметазона и гипоксии на общее развитие и морфологию головного мозга
3.2.1 Вес тела после введения дексаметазона и гипоксии
3.2.2 Морфология мозга после введения дексаметазона
3.3 Влияние дексаметазона и гипоксии на апоптоз клеток головного мозга
3.3.1 Морфология мозга после введения дексаметазона и эпизода гипоксии
3.3.2 Экспрессия активной каспазы-3 после введения дексаметазона и гипоксии через 120 часов после воздействия
3.4 Острое действие глюкокортикоидов на активность клеток гиппокампа и апоптоз клеток дорзального субикулума
3.4.1 Экспрессия каспазы-3 в гиппокампальной формации через 6ч. после введения дексаметазона
3.4.2 Количество клеток позитивных по реакции на фрагментированную ДНК ІтиИЕІ.) в дорзальном субикулуме через 6ч. после введения дексаметазона
3.4.3 Экспрессия каспазы-3 в неокортексе через 6ч. после введения дексаметазона
3.4.4 Экспрессия гена раннего ответа с-/оз в первые часы после введения гормона
3.5 Влияние блокады рецепторов глутамата на индуцируемую дексаметазоном гибель клеток субикулума
3.5.1 Количество клеток позитивных по активной каспазе-3 в дорзальном субикулуме через 6ч. после введения дексаметазона и анатагониста глутаматных рецепторов мемантина
3.5.2 Количество клеток позитивных по реакции тиИЕІ. е дорзальном субикулуме через 6ч. после после введения дексаметазона и анатагониста глутаматных рецепторов мемантина.

Глава 4.Обсуждение
ВЫВОДЫ
Библиография

Список сокращений
3-МА — З-Метиладенин
АКТГ — адренокортикотропный гормон.
БЛД — бронхолёгочная дисплазия
ГГНС - гипоталамо гипофизарно надпочечниковая система ДЦП — детский церебральный паралич
ОТ-ГГЦР — полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией.
ПКГ — программируемая клеточная гибель.
аПКГ — аутофагическая программируемая клеточная гибель.
РДС — респираторный дистресс синдром ЦНС — центральная нервная система ЭР — Эндоплазматический ретикулум
Apaf (Apoptotic protease-activating factor) — апоптозный протеазо-активирующий фактор. АМРА рецептор — рецептор а-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоты
Вах (Bcl-2-associated х protein) — Вс1-2-ассоциированный х белок.
Bel (В-Cell Lymphoma) — В-клеточная лимфома.
Bc1-Xl (BcI-2 X-linked protein) — Bcl-2 Х-связанный белок.
ВН домен (Bcl-2 Homology) — домен Вс1-2 гомологии.
СА (Cornu Ammonis) —Аммонов рог
CAD (Caspase-Activated DNase) — каспазо-активируемая ДНКаза.
CARD (Caspase-Associated Recruitment Domain) — каспазо-ассоциированный домен взаимодействия.
CED ген (Caenorhabditis Elegans Death) — ген гибели Caenorhabditis elegans.
DBD (DNA Binding Domain) — ДНК-связывающий домен.
DED (Death Effector Domain) — домен эффектора гибели.
DEX (Dcxamethasone) — дексаметазон Е_дата
GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein) — глиальный фибрилярный кислый белок GR (Glucocorticoid Receptor) — глюкокортикоидный рецептор.
GRE (Glucocorticoid Response Element) — глюкокортикоид-респонсивный элемент.
HIF (Hypoxia Inducible Factors) транскрипционные факторы, индуцируемые гипоксией HRE (Hypoxia Response Element) гипоксия респонсивные элементы IAP (Inhibitor of Apoptosis Protein) — белки-ингибиторы апоптоза.

последовательности промотора этого гена выявил также присутствие сайтов связывания для таких транскрипционных факторов как Ets-1, HIF, и СЕВРВ (Liu et al., 2002).
Неактивная форма каспазы-3 состоит из одной полипептидной цепи длиной 277 аминокислот (32кДа). Превращение в активную форму происходит в результате двух разрезаний этой цепи. Одно отделяет продомен от большой субъединицы, а второе разделяет большую и малую субъединицы (Eamshaw et al., 1999). По субстратной специфичности каспаза-3 относится к подгруппе протеаз предпочтительно гидролизующих белки-мишени по карбоксиконцевой позиции мотива DEXD. Известными клеточными субстратами каспазы 3 являются структурные компоненты (такие как актин и ламинин ядерной оболочки), регуляторные компоненты (такие как ДНК-зависимая протеин киназа), ингибиторы ДНКаз (такие как DFF45 или ICAD), а также другие проапоптозные белки и каспазы (Shi, 2002). IAP белки являются естественными ингибиторами каспазы-3 (Deveraux, Reed, 1999). Сама каспаза-3 может активироваться различными индуцирующими каспазами (Hengartner, 2000).
Ключевыми регуляторами активации каспаз и, следовательно, апоптоза
являются Вс1-2 подобные белки (Chao, Korsmeyer, 1998; Reed, 2000; Bouillet,
Strasser, 2002; Borner, 2003; Degterev et al., 2003; Willis et al., 2003).
Семейство Bcl-2 подобных белков состоит как из проалоптозных, так и
антиапоптозных членов (Chao, Korsmeyer, 1998). В него входят три основные
подгруппы, которые классифицируются согласно их анти- или про-
апоптозной функции, а также наличия консервативных структурных мотивов
- ВН доменов (the Вс12 homology domain) (Benn, Woolf, 2004). Обнаружено
вида ВН доменов, обозначаемых ВН1, ВН2, ВНЗ, ВН4. Антиапоптозные
члены Вс1-2 семейства, такие как Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w и Mcl-1, типично
имеют четыре ВН домена (ВН1-4). Белки второй проапоптозной
мультидоменной подгруппы семейства обладают по крайней мере ВН1 и
ВН2 доменами и группа включает Вах, Вак, Вок, Bcl-Xs. В третью, наиболее