Вирусный гепатит C: новые подходы к изучению патогенеза и разработка средств диагностики и профилактики

• Автор: Масалова, Ольга Владимировна
• Шифр специальности: 03.02.02
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 336 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. ВИРУС ГЕПАТИТА С: ПАТОГЕНЕЗ, ДИАГНОСТИКА И

ПРОФИЛАКТИКА

1.1. Эпидемиология и клиническое течение гепатита С

1.2. Молекулярная организация вируса гепатита С

1.2.1. Структура вириона

1.2.2. Организация вирусного генома

1.2.3. Структура и функции вирусных белков

1.2.4. Жизненный цикл ВГС
1.2.5. Антигенная структура белков ВГС и методы картирования В-клеточных
эпитопов
1.3. Иммунопатогенез вирусного гепатита С
1.3.1. Врожденный иммунный ответ
1.3.2. Адаптивный иммунный ответ
1.3.3. Иммунный статус больных гепатитом С
1.3.4. Лечение гепатита С
1.3.5. Вирусные и хозяйские факторы, связанные с исходом ОГС и
эффективностью ШИ-терапии
1.4. Разработка вакцин против гепатита С
1.5. Молекулярные основы диагностики гепатита С
1.5.1. Определение маркеров ВГС в сыворотке крови
1.5.2. Выявление ВГС в инфицированных клетках больных гепатитом С
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Характеристика клинического материала
2.2. Лабораторные животные и клеточные линии
2.3. Основные материалы (рекомбинантные белки, синтетические
пептиды, ДНК-конструкции, адъюванты)
2.4. Получение гибридом, продуцирующих моноклональные
антитела (МКА) к рекомбинантным белкам вируса гепатита С
2.5. Биохимические и иммунохимические методы исследования
2.5.1. Определение концентрации белка
2.5.2 Изотипирование МКА
2.5.3. Очистка МКА. из асцитных жидкостей
2.5.4. Приготовление конъюгатов
2.5.5. Подготовка биологического материала

2.5.6. Иммуноферментный анализ (ИФА)
2.5.7. Реакция иммунофлюоресценции
2.5.8. Иммуногистохимическое и иммуноцитохимическое окрашивание in situ
2.5.9. Выявление белков ВГС в МКПК методом проточной цитофлюориметрии
2.5.10. Иммуноблоттинг и иммунодот
2.5.11. Истощение МКА и сывороток
2.6. Картирование антигенных детерминант белков ВГС с помощью технологии фагового дисплея
2.7. Иммунологические методы исследования
2.7.1. Реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ)
2.7.2. Определение содержания популяций лимфоцитов
2.7.3 ELISpot
2.7.4. Определение содержания цитокинов
2.7.5. Определение содержания растворимых форм дифференцировочных антигенов
2.8. Детекция РНК вируса гепатита С и генотипирование ВГС
2.9. Статистическая обработка результатов
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ, ХАРАКТЕРИСТИКА И ЭПИТОПНАЯ
СПЕЦИФИЧНОСТЬ МКА
3.1. Получение МКА к рекомбинанатным белкам core, NS3, NS4 и NS5 ВГС
3.2. Иммунохимические свойства МКА
3.3. Эпитопная специфичность МКА
3.4. Взаимодействие МКА с денатурированными антигенами
3.5. Реципрокный конкурентный анализ МКА
3.6. Конкуренция МКА с антителами в сыворотках больных гепатитом С
3.7. Картирование антигенных детерминант с помощью технологии фагового дисплея
ГЛАВА 4. ВЫЯВЛЕНИЕ ВГС В МАТЕРИАЛАХ ОТ БОЛЬНЫХ ГЕПАТИТОМ С
4.1. Детекция РНК ВГС в материалах от больных гепатитом С
4.2. Экспрессия вирусных белков в клетках печени у пациентов с острым и хроническим гепатитом С
4.3. Детекция белков ВГС в мононуклеарных клетках периферической крови
4.3.1. Выявление белков ВГС в клетках крови in situ
4-3.2. Анализ белков ВГС в клетках крови методом проточной цитометрии
4.4. Обнаружение белков ВГС в лизатах инфицированных клеток
4.5. Количественное определение содержания белка core ВГС в сыворотке и плазме крови
4.5.1. Разработка метода выявления core-белка ВГС

4.5.2. Анализ содержания соге-белка в сыворотках больных гепатитом С
ГЛАВА 5. ИССЛЕДОВАНИЕ ИММУННОГО ОТВЕТА НА ВГС-ИНФЕКЦИЮ И АНАЛИЗ ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО СТАТУСА БОЛЬНЫХ ГЕПАТИТОМ С
5.1. Активность антител к белкам ВГС в сыворотке и плазме крови
5.2. Анализ относительного содержания различных популяций
клеток крови
5.3. Изменение содержания растворимых форм
дифференцировочных антигенов в сыворотках крови больных гепатитом С
5.4. Цитокиновый профиль больных гепатитом С
ГЛАВА 6. ИНДУКЦИЯ И АНАЛИЗ ИММУННОГО ОТВЕТА НА ИММУНИЗАЦИЮ МЫШЕЙ РЕКОМБИНАНТНЫМИ БЕЛКАМИ
ВГС, ОТДЕЛЬНЫМИ ДЕТЕРМИНАНТАМИ И ДНК
КОНСТРУКЦИЯМИ
6.1. Иммунный ответ на введение рекомбинантных белков
6.2. Иммунный ответ при иммунизации мышей ВГС-
специфическими фагами и синтетическими пептидами
6.3. Анализ иммунного ответа на ДНК-иммунизацию
6.4. Сочетанная иммунизация животных рекомбинантными
белками и ДНК-конструкциями
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

применением репликона показали, что в клетках Huh7 NS2 может фосфорилироваться, что, по-видимому, стабилизирует белок. Предполагают, что NS2 может быть вовлечен в процесс сборки вирусных частиц | Jirasko et al., 2010, Yi et al., 2009].
Комплекс NS3-NS4A. Белок NS3 (67 кД) локализуется между 1027 и 1658
а.о. полипротеина ВГС и обладает тремя каталитическими функциями: сериновая протеиназа, нуклеозидтрифосфатаза (ЫТРаза) и РНК-хеликаза. NS3, экспрессированный отдельно от других белков, локализуется в цитоплазме и ядре. Однако, при коэкспрессии его с кофактором NS4A, NS3 находят в составе мембран ЭР в цистернах вокруг митохондрий [Dimitrova et al., 2003]. Известно, что N-концевой домен NS4A имеет вторичную структуру типа а-спирали, которая является мембранным якорем для комплекса NS3-4A [Sharma, 2010].
Функция сериновой протеиназы хорошо охарактеризована. Показано, что протеиназа играет ключевую роль в процессинге полипротеина ВГС, в связи с чем является важной мишенью в антивирусной терапии. Данная активность сопряжена с N-концевой третью белка (первые 181 а.о. белка или 1027-1207 а.о. полипротеина) и осуществляется независимо в ходе двух событий вирусного процессинга: при расщеплении NS2/NS3, когда эту функцию совмещают два белка, локализованные в районе 827-1207 а.о. полипротеина, и при расщеплении в сайтах NS3/4A, NS4A/4B, NS4B/5A и NS5A/5B с участием кофактора NS4A. Расщепление полипротеина между NS5A и NS5B может проходить без участия кофактора NS4A, но с меньшей эффективностью [Appel et al., 2006, Tang, Grise, 2009].
Сравнение аминокислотных последовательностей нескольких изолятов ВГС показало, что NS3 имеет высококонсервативные а.о. в положениях His 1083, Asp 1107 и Seri 165, которые составляют каталитическую триаду в семействе сериновых протеиназ. Причем Hisl083 и Aspll07 располагаются в составе одного [1-цилиндра, a Seri 165 - в составе другого, [1-цилиндры сближены друг с другом в пространстве. Неустойчивая связь между NS3/4A расщепляется в cis-положении, в то время как процессинг NS4A/4B, NS4B/5A, и NS5A/5B сайтов