Разработка и использование молекулярных маркеров на основе ПЦР-метода в селекции клевера лугового : Trifolium pratense L.

• Автор: Клименко, Ирина Александровна
• Шифр специальности: 06.01.05
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 150 с. : ил.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Значение клевера как кормовой культуры; проблемы селекции клевера
1.2. Системы молекулярного маркирования генома
1.3. Использование молекулярных маркеров в современной селекции
1.4. Генетические карты и их использование в селекции
растений
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 3
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Глава 3.1. Описание и поддержание экспериментальной популяции клевера лугового ГП-27
3.1.1. Оценка фенотипического варьирования признаков
3.1.2. Введение генотипов изучаемой популяции в культуру in vitro
Глава 3.2. Молекулярный анализ и создание генетической карты сцепления клевера лугового
3.2.1. Оптимизация условий выделения ДНК из растительной ткани клевера
3.2.2. Сравнительный анализ различных систем молекулярного маркирования
3.2.3. Оптимизация условий и параметров PCR с использованием рандомных праймеров (RAPD-PCR)
3.2.4. Использование праймеров с дополнительным селективным нуклеотидом для повышения надёжности RAPD-маркеров
3.2.5. Исследование ДНК-полиморфизма с использованием сиквенс-специфических праймеров (STS-технология)
3.2.6. Детекция ДНК-полиморфизма с помощью CAPS-маркеров

3.2.7. Использование ДНК-маркеров в создании генетической
карты клевера лугового (Trifolium pratense L.)
Глава 3.3. Анализ косегрегации полученных ДНК-маркеров с фенотипическими проявлениями устойчивости растений
3.3.1. Оценка зимостойкости гибридной популяции ГП
в различных условиях
3.3.2. Оценка устойчивости к склеротиниозу (Sclerotinia trifoliorum Erikss.)
3.3.3. Детекция локусов генов, связанных с признаками устойчивости и локализация их на интегрированной генетической карте
3.3.4. Выделение новых источников хозяйственно ценных признаков для селекции клевера лугового
ВЫВОДЫ
ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ СЕЛЕКЦИОННОЙ ПРАКТИКИ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЯ

Клевер луговой - одна из важнейших кормовых бобовых культур, распространённых в регионах с влажным умеренным климатом. Большинство сортов, используемых сегодня, являются диплоидными (2п=2х=14), перекрёстноопыляющимися видами, с гаметофитной самонесовместимой системой.
Большое народнохозяйственное значение клевера определяется тем, что он является источником дешевого кормового растительного белка и высокоэнергетических кормов, сохраняет почву от водной и ветровой эрозии и повышает плодородие почвы, фиксируя азот.
Однако реализация потенциала клевера как кормовой культуры в настоящее время ограничена недостатком сортов с улучшенными хозяйственными характеристиками, в частности, раннеспелостью, зимостойкостью, долголетием и устойчивостью к различным неблагоприятным факторам среды, болезням и вредителям.
Важнейшая роль в создании сортов, отвечающих требованиям современного кормопроизводства, принадлежит селекции. Как правило, для создания новых сортов с улучшенными характеристиками применяется фенотипический отбор с последующей рекомбинацией генетических вариаций. В большинстве случаев селекционер работает со сложными признаками, которые контролируются большим количеством генов, а их фенотипическое проявление существенно варьирует в зависимости от условий внешней среды. В связи с этим суждение о генетической ценности материала, основанное на фенотипическом проявлении его признаков и свойств, в определённой степени ошибочно. Вот почему повышение эффективности оценки исходного материала и отбора перспективных форм является коренным вопросом селекции (Серебровский, 1970).
Эти задачи особенно актуальны в исследованиях клевера, что обусловлено особенностями его генетической структуры. Сорта и популяции

Для получения CAPS-маркеров использовали методику расщепления продуктов амплификации предварительно проведённой PCR (Williams et al., 1990) рестрикционными эндонуклеазами, что позволяло выявить полиморфизм внутри амплифицированного фрагмента ДНК. Процедура выполнялась в соответствии с методом, разработанным Akopianz et al. (1992). Мы разрезали продукты сиквенс-специфической; амплификации 4-основной рестриктазой Rsal и 6-основной рестриктазой EcoRl («Boehringer Mannheim» Germany). Для растворения ферментов применялся: IX Multicore-буфер (Promega Cetus, USA). Смесь из 0,1-0,2 ед. фермента и 5 мкл Multicore-буфера добавляли к 3-5 мкл PCR-продукта. Подготовленные образцы инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 6-12 часов в зависимости от количества добавленного фермента.. После инкубации полученные продукты разделяли в агарозном геле для детекции CAPS-маркеров и визуализировали путём выдерживания в бромистом этидии.
Лабораторный опыт по оценке устойчивости отдельных генотипов, экспериментальной популяции к склеротиниозу (Sclerotinia trifoliorum-Erikss.) осуществили для отбора контрастных по устойчивости форм в исследуемой популяции и выявления потенциальной СВЯЗИ! с генетическими’ маркерами. Опыт поставлен на генетически однородном материале (растения в одинаковом возрасте и одной стадии развития) в строго контролируемых условиях. Работа проводилась совместно со специалистами лаборатории иммунитета ВНИИ кормов на основе метода ранней диагностики устойчивости клевера лугового к болезням (Разгуляева, Костенко, Пуца, 1999); Тройчатые листья клевера. двухмесячного возраста раскладывали в растильни на вату, смоченную 0,005% водным раствором бензимидазола, замедляющего процессы старения тканей и поддерживающего их тургор. На каждый лист пипеткой1 наносили: по 2 капли суспензии возбудителя. Растильни помещали на сутки в камеру искусственного климата с рассеянным светом и температурой: 14-16°С. Затем размещали их в камере с