Разработка метода получения трансгенных растений сахарной свеклы, устойчивых к гербицидам

• Автор: Богомолова, Наталья Михайловна
• Шифр специальности: 06.01.05
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Рамонь
• Количество страниц: 106 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Генетическая трансформация растений с помощью Agrobacterшm ШтеГашепя

1.1.1. Взаимодействие между AgroЪacterшm и растительной

клеткой

1.1.2. Строение Т1-плазмиды

1.1.3. Перенос Т-ДНК

1.1.4. Особенности строения плазмидных векторов и генетическая трансформация растений
1.2. Гербициды широкого спектра действия
1.2.1. Общая характеристика гербицидов широкого спектра действия
1.2.2. Механизмы действия гербицидов глифосата и фосфинот-рицина
1.3. Инженерия растений, устойчивых к гербицидам широкого спектра действия
1.3.1. Трансгенные растения, устойчивые к глифосату
1.3.2. Трансгенные растения, устойчивые к фосфинотрицину
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Характеристика растительного материала и плазмидных векторов, используемых в работах по трансформации
2.2. Характеристика методов исследования
2.2.1. Выделение эксплантов и регенерация растений
2.2.2. Трансформация сахарной свеклы
2.2.3. Анализ ядерной ДНК растений
2.2.3.1. Выделение и очистка ядерной ДНК(яДНК) растений.

2.2.3.2. Рестрикция яДНК
2.2.3.3. Получение ДНК-зонда для гибридизации с яДНК
2.2.3.4. ДОТ-гибридизация яДНК
2.2.3.5. Саузерн-блоттинг яДНК
2.2.4. Цитогенетический анализ
2.2.5. Статистическая обработка
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Разработка системы регенерации сахарной свеклы путем прямого органогенеза
3.1.1. Влияние генотипа
3.1.2. Значение экспланта
3.1.3. Роль питательной среды
3.1.4. Влияние условий культивирования
3.2. Трансформация сахарной свеклы с использованием
А§гоЬас1егшга ШтеЬас1епз
3.2.1. Определение параметров кокультивирования эксплантов с А§гоЪас1епиш
3.2.2. Получение трансформированных растений
3.3. Молекулярно-биологический анализ трансформированных растений
3.3.1 Анализ хромосомной ДНК методом ДОТ-гибридизации
3.3.2 Анализ хромосомной ДНК методом Саузерн-блоттинга
3.4. Биологические особенности трансгенных растений
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИС ОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
вмцк - вирус мозаики цветной капусты
БАЛ - 6-бензиламинопурин
ГК - гибберелловая кислота
ИМК - 3-индолилмасляная кислота
ИУК - индолилуксусная кислота
2,4 Д - 2,4 дихлорфеноксиуксусная кислота
ЭДТА - этилендиаминтетраацетат
- додецилсульфат натрия
СЬ - карбенициллин
СД - цефотаксим
Кт - канамицин
8т - спектиномицин

бы центрифугировали 10 мин (10 тыс. об/мин) и фильтровали надоса-дочную жидкость в чистые пробирки. Осаждали ДНК изопропанолом и отмывали осадок 70% этанолом. Осадок растворяли в 1 мл дистиллированной Н20. Препарат последовательно обрабатывали ДНКазой и про-теиназой К. Последовательно проводили очистку препарата фенолом, смесью фенол/хлороформ, хлороформом. Повторно осаждали ДНК 95% этанолом и дважды промывали 70% этанолом. Осадок растворяли в 50 мкл деионизованной Н20. Концентрацию препаратов ДНК определяли по интенсивности флуоресценции в ультрафиолете связанного с ДНК бромистого этидия (Маниатис и др., 1984).
2.2.3.2. Рестрикция я ДНК
Рестрикцию проводили согласно рекомендациям изготовителей ферментов (НПО “Фермент”, Вильнюс).
ДНК в количестве приблизительно 1 мкг инкубировали с избытком фермента. Гидролиз проводили в 100-200 мкл реакционной смеси в течение 4 ч при температуре 37°С.
Фрагменты ДНК разделяли методом электрофореза в горизонтальных 0,7% гелях (агароза марки Sigma, тип 1). Электрофорез вели 16-18 ч при напряжении 20 В в трис-ацетатном буфере. После электрофореза гель помещали в водный раствор бромистого этидия для окрашивания ДНК (Маниатис и др., 1984).
2.2.3.3. Получение ДНК-зонда для гибридизации с яДНК
Выделение и очистку плазмидной ДНК с соответствующим геном (bar или мутантный агоА) проводили методом щелочного лизиса (Маниатис и др., 1984). Необходимый фрагмент плазмиды получали путем последующих этапов рестрикции и гель-электрофореза в легкоплавкой агарозе (Маниатис и др., 1984). Фрагмент ДНК, выбранный в качестве