Усовершенствование технологии изготовления инактивированной вакцины против бешенства

• Автор: Лаптева, Оксана Георгиевна
• Шифр специальности: 16.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Покров
• Количество страниц: 132 с.

1. Введение

2. Литературный обзор

2.1. Эпизоотологическая справка по бешенству

2.2. Характеристика вируса бешенства

2.3. История изготовления вакцин против бешенства

2.4. Культивирование вируса бешенства

2.5. Инактивированные вакцины против бешенства

и методы их контроля

3. Собственные исследования

3.1. Материалы и методы

3.2. Результаты исследований

3.2.1. Выбор чувствительной клеточной модели и
системы культивирования
3.2.2. Разработка технологии выращивания клеток в суспензии
3.2.2.1. Роллерное культивирование
3.2.2.2. Спиннерное культивирование
3.2.2.3. Хранение клеток
3.2.3. Разработка технологии получения вирусного сырья
в суспензии
3.2.3.1. Роллерная суспензия
3.2.3.2. Спиннерная суспензия
3.2.3.3. Хранение вирусного сырья
3.2.4. Усовершенствование технологии изготовления инактивированных антирабических вакцин
3.2.4.1. Выбор штамма вируса
3.2.4.2. Условия инактивации
3.2.4.3. Конструирование вакцинных препаратов
3.2.4.4. Изготовление производственных серий
инактивированных вакцин
3.2.4.5. Условия хранения вакцин
3.2.5. Разработка схемы иммунобиологического контроля и
условий применения инактивированных вакцин
3.2.5.1. Оценка безвредности и иммуногенности вакцин
3.2.5.2. Влияние кратности прививки на поствакцинапьны иммунитет
3.2.5.3. Изучение длительности иммунитета
3.2.6. Рекомендации по технологии
изготовления и контролю вакцины
4; Обсуждение
5. Выводы
6. Практические предложения
7. Список литературы
8. Приложения
Список сокращений
АГ - антиген
ВНК-21- перевиваемая линия клеток почки новорожденного сирийского хомячка БСА- бычий сывороточный альбумин ВН-антитела- вируснейтрализующие антитела в/м - внутримышечно в/б - внутрибрюшинно ЗФР - забуферный физиологический раствор
ИмДзо - 50%-ная иммунизирующая доза
ИРТ инфекционный ринотрахеит
КРС - крупный рогатый скот
ККИД50 - 50%-ная культурально - клеточная инфекционная доза
МН- микроносители
МЛД50 - 50%-ная мышиная летальная доза
МФА - метод флюоресцирующих антител МЕ - международные единицы
ПЭКр-85 - перевиваемая линия клеток почки эмбриона кролика
ПС - перевиваемая линия клеток почки сайги
ПТП - перевиваемая линия клеток тестикул поросенка
PH - реакция нейтрализации
CV -1 - перевиваемая линия клеток почки африканской зеленой мартышки
ТФ ИФА - твердофазный иммуноферментный анализ ТЦЦ50- 50%-ная тканевая цитопатическая доза ФГМ - ферментативный гидролизат мышечный ЦПД - цитопатическое действие ЭД5о - 50%-ная эффективная доза NIH - тест Национального Института Здравоохранения
Vero - перевиваемая линия клеток почки африканской зеленой мартышки
HABEL- Модифицированный тест NIH, разработанный Karl Habel

МДВК- перевиваемая линия клеток почки теленка Wi-3 8 диплоидная культура клеток легкого человека NIL-2 перевиваемая линия клеток фибробласты хомяка
1. Введение
Из болезней вирусной этиологии наиболее значимой в эпизоотическом и эпидемическом отношениях можно считать бешенство - болезнь, опасную для человека и теплокровных животных всех видов (И.А. Бакулов, 1998). Ведущее место в противоэпизоотических и противоэпидемических мероприятиях по бешенству занимает вакцинопрофилактика. С этой целью используют как живые, так и инактивированные вакцины. Для вакцинации домашних и сельскохозяйственных животных применяют, как правило, инактивированные вакцины, а для профилактики бешенства среди диких млекопитающих вирусвакцины орального применения (П.П. Кузнецов, B.C. Иванов, С.В. Кузнецова, 1979; Prosperi, Poglayen, Irsara, 1980; К.К. Керимбеков, К.К. Муралинов, А.Ж. Уразбахова, 1981; Johnston, Voigt, 1982; Steck, Wandeier, Bichsel et al., 1982).
В современной биотехнологии антирабических противовирусных препаратов используют различные вакцинные штаммы - Paris Pasteur, Pitman Moore, ERA, Внуково-32, Щелково-51, ТС-80, РВ-97 и др., (Barth R., Franke V., Selimov M.A., 1973; Rifky M. El-Karamany, 1987; B.B. Недосеков, 2003), которые выращивают в первичных и перевиваемых клеточных культурах ПСХ, ВНК-21, ПС, Vero, и др., применяя различные методические приемы культивирования - пристеночный монослой (стационарный, роллерный) и перемешиваемые культуры (суспензионный, псевдосуспензионный) (Atanasiu, Perrin, Segre, Manganas, 1981; M.A. Селимов, JI. Эльберт, Т.А. Аксенова, 1982; Fangtao Lin et al, 1983; Guidolin et al, 1983; M.A. Селимов, Л.Ф. Грибенча, 1984; B.C. Иванов, 1995; И.Ф. Вишняков, И.В. Никишин, В.В. Недосеков, 1998; В.В. Михалишин, М.В. Гочмурадов, Т.И. Корпусова, 1999). Используемые в настоящее время технологии получения вирусного сырья для изготовления инактивированных антирабических вакцин являются весьма трудоемкими, экономически не эффективными и в некоторых случаях не позволяют получать без дополнительных технологических приемов профилактические антирабические препараты требуеКультивирование клеток проводили без аэрации. Скорость перемешивания в 5 л ферментере составляла 100-120 об./мин, в 20 л - 170-200 об/мин.
По данным таблицы 5, прирост клеток в культиваторах зависел от объемов культуральных аппаратов и степени их заполнения. Независимо от объемов используемых в опытах культиваторов максимальный прирост клеток В НК-21 (2,3-2,9 млн./мл) во взвеси отмечали при степени заполнения их на 0,3-0,5 емкости. Увеличение объемов заполнения реакторов (выше 0,7) значительно снижало конечную плотность получаемой клеточной суспензии (на 0,8-1,4 млн. клеток/мл) при культивировании без аэрации среды. Влияние скорости перемешивания суспензии на динамику клеточной пролиферации ВНК-21 (мексиканской сублинии) было определено ранее (1992) в работе Т.В. Кала-миной.
З.2.2.З. Хранение клеток
Одной из не менее важных задач в технологии культивирования клеток является процесс их кратковременного и длительного хранения при промышленном производстве биосырья (В.И. Жестерев, С.Г. Юрков, 2003).
В наших опытах субстрат клеток ВНК-21 хранили при температуре 4-8°С и при 18-20°С в среде культивирования. На протяжении, периода хранения за культурой вели наблюдение (табл. 6).
Как показали опыты, на 3 сутки хранения при 4-8°С наблюдали появление конгломератов, состоящих из 20 и более клеток, незначительное число одиночных и парных клеток. К 6 суткам число клеток в конгломератах увеличилось до 50 и более клеток. В центре конгломератов хорошо просматривались мертвые клетки, цитоплазма которых окрашивалась 0,5%-ным раствором трипанового синего. По морфологии клетки оставались мелкими, зернистыми, появилось много детрита. Более длительное хранение приводило к снижению жизнеспособности клеток до 77% и концентрации в 2 раза на 8 сутки наблюдения, в дальнейшем отмечали гибель клеток на 11 сутки хранения.