Тест-системы на основе иммуноферментного анализа для определения антител к вирусу болезни Ауески

• Автор: Яснева, Елена Анатольевна
• Шифр специальности: 16.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Владимир
• Количество страниц: 130 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
БА - болезнь Луески
ВБА - вирус болезни Аусски
ВНА - вируснсйтрализукнцие антитела
ВНК-21 - перевиваемая культура клеток почки сирийского хомячка
ВН-тест — вирусней грализующий тест
в/м - внутримышечно
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ИФА - иммуноферментный анализ
и/ц - интрацеребрально
КГ-91 (Ch-91) - перевиваемая культура клеток гонад козы
КРС - крупный рогатый скот
КТТ — перевиваемая линия клеток тимуса теленка
МАт - моноклональные антитела
ОП - оптическая плотность
ОФД - ортофенилендиамин
ГГГ - перевиваемая линия клеток почки теленка
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ПЭГ - поли.тгилснгликоль
РПК - рибонуклеиновая кислота
PH - реакция нейтрализации
СЭК — перевиваемая линия клеток селезенки эмбриона коровы ТК - тимидинкиназа
ТЦД'зо - 50%-ная тканевая цитопатическая доза
ТЭК — перевиваемая линия клеток тимуса эмбриона коровы
Ц11Д - цитопатическое действие
ЦНС - центральная нервная система
ELISA - иммуноферментный анализ
Ig - иммуноглобулин
lg - десятичный логарифм

ОГЛАВЛЕНИЕ
С1 р
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Историческая справка о распространении болезни Ауески
1.2. Эпизоотическая ситуация по болезни Ауески в мире и Российской I
Федерации 1 J
1.3. Характеристика вируса болезни Ауески
1.3.1. Морфология
1.3.2. Устойчивость возбудителя к факторам внешней среды
1.4. Клинические признаки болезни Ауески
1.5. Культивирование вируса болезни Ауески
1.6. Очистка и концентрирование вируса болезни Ауески
1.7. Иммунитет при болезни Ауески
1.7.1. Неспецифические факторы защиты
1.7.2. Гуморальный иммунитет
1.7.3. Клеточный иммунитет
1.7.4. Белки иммунного ответа
1.8. Методы диагностики болезни Ауески -> -» Э J
1.8.1. Выделение возбудителя
1.8.2. Серологические методы диагностики
1.8.2.1. Иммуноферментный метод диагностики
1.8.2.2. Дискриминирующие диагностические тесты
1.9. Вакцины против болезни Ауески
1.10. Искоренение болезни Ауески
1.11. Заключение но обзору литературы
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. МАТЕРИАЛЫ
2.1.1. Вирусы
2.1.2. Животные
2.1.3. Культуры клеток
2.1.4. Питательные среды

2.1.5. Оборудование и инструменты
2.1.6. Растворы и химреактивы
2.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.2.1. Культивирование вируса болезни Ауески
2.2.2. Определение инфекционной активности вируса болезни Ауески
2.2.3.11олучение антигенов вируса болезни Ауески
2.2.4. Получение гипериммунных сывороток крови свиней
2.2.5. Получение гипериммунных сывороток крови кроликов
2.2.6. Получение иммуноглобулинов сывороток крови кроликов
2.2.7. Постановка непрямого варианта иммуноферментного анализа
2.2.8. Статистическая обработка результатов
2.2.9. Компьютерный учет результатов
2.3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.3.1. Культивирование вируса болезни Ауески
2.3.1.1. Культивирование маркированного штамма «ВК»
2.3.1.2. Культивирование эпизоотического штамма «К»
2.3.2. Получение антигенов вируса болезни Ауески штаммов «ВК» и «К» и специфических иммуноглобулинов сывороток кроки кроликов
2.3.3. Получение гипериммунных сывороток крови свиней (,(ц
2.3.3.1. Получение гипериммунных сывороток крови свиней на маркированный
и эпизоотический штаммы вируса болезни Ауески
2.3.3.2. Получение гипериммунных сывороток крови свиней одновременно содержащих антитела к маркированному и эпизоотическому штаммам вируса болезни Ауески 7 *
2.3.4. Усовершенствование тест-системы для выявления антител на основе твердофазного непрямого варианта ИФА с иммобилизуемым антигеном в виде ст руктурно-целостного вируса болезни Ауески штаммов «13К» и «К»
2.3.4.1. Оптимизация условий постановки непрямого варианта иммуноферментного анализа
2.3.4.1.1. Определение оптимальной концентрации иммобилизуемого антигена
2.3.4.1.2. Оптимизация условий иммобилизации антигенов

диагностики атипичного течения болезни, при котором опыты по выявлению вируса в мозге свиней путем заражения кроликов дают отрицательные или нетипичные результаты [8]. Наиболее чувствительные к вирусу болезни Ауески являются культуры клеток, полученные из органов свиней.
Идентификацию реплицировавшегося вируса осуществляют с помощью иммунофлуоресценции или с помощью иммунопероксидазного окрашивания инфицированных клеток [27, 68, 118, 202], к недостаткам данных методов следует отнести важность сохранности ткани инфицированного животного, что не всегда соблюдается на практике. чКроме этих методов, разработаны методы прямого выявления вирусного антигена в тканях животных и биологических жидкостях с помощью твердофазного иммуноферментного анализа — метод, который мало зависит от качества образца ткани [192]. Во всех этих методах описано использование поликлональных и моноклональных ВБА - специфических антител.
Разработаны методы выявления ДНК ВБА с помощью дот/блог гибридизации с радиоактивно меченными или биотинилированными фрагментами ДНК. гибридизации in situ [96, 161 ]. Разработан также ряд методов детекции ДНК ВБА с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) [112. 184. 195].’ При лом, посредством in situ гибридизации и ПЦР, выявляется как ДНК ВБА. так и транскрипционные продукты ВБА. Высокая чувствительность молекулярно-биологических методов в выявлении генома ВБА (до 10'15 г) ВБА-специфичных нуклеиновых кислот [181] позволяет выявлять латентно инфицированных животных. В ряде случаев, однако, молекулярно-биологические методы дают высокий уровень ложноположительных результатов.
Диагностика БА по выявлению вирусного антигена в тканях животных пли по изоляции возбудителя эффективна только в острую фазу инфекции или в случаях (очень редких) реактивации вируса из латентного состояния [181, 2321. Выявление вируса при спонтанной реактивации очень трудно провести, так как заболевание клинически не проявляется. Отдельные полевые вирусные штаммы вызывают заболевание в клинически стертой форме, что также в большинстве случаев не идентифицируется. Неудивительно, что в полевых условиях для выявления инфицированных животных наиболее широко используют