Разработка тест-системы для определения видовой принадлежности мясных ингредиентов в кормах методом полимеразной цепной реакции

• Автор: Сорокина, Мария Юрьевна
• Шифр специальности: 16.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 104 с. : ил.

Список СОКРАЩЕНИЙ
Актуальность проблемы
Цель и задачи исследования
Научная новизна работы
Практическое значение работы
Апробация диссертации
Объем и структура диссертации
ЧАСТЬ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Проблема определения видовой принадлежности мясных ингридиентов
2. Молекулярные методы определения видовой принадлежности мясных ингредиентов в кормах
3. Принцип полимеразной цепной реакции
4. Подбор праймеров
4.1. Дизайн праймеров
4.2. Температура отжига
4.3. Длина праймеров
4.4. Вырождение праймеры
5. Факторы воздействующие на ПЦР
5.1. Температура и время денатурации
5.2. Температура и время элонгации
5.3. Реакционный буфер
5.4. Количество циклов амплификации
5.5. «Горячий старт» ПЦР
5.6. Контаминация в ПЦР и предложения по обустройству ПЦР-лаборатории
5.8. Внутренний контрольный образец (ВКО)
ЧАСТЬ 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Базы данных нуклеотидных последовательностей ДНК и компьютерные программы для обработки этих данных
2. Образцы-сравнения ДНК
2.1. Коммерческие препараты ДНК

2.2. Самостоятельно полученные образцы ДНК из цельной крови животных
3. Образцы кукурузной, куриной, рыбной и мясокостной муки
3.1. Отбор образцов
3.2. Приготовление смесей
3.3. Перечень видов смесей кормовой муки
4. Образцы сухого и консервированного корма для животных
5. Образец сыворотки лошадей
6. Методика выделения ДНК из цельной крови по Maniatis (94)
6.1. Выборочный лизис эритроцитов
6.2. Обработка лейкоцитарного осадка протеиназой К
6.3. Экстракция ДНК фенол-хлороформом с последующей преципитацией этанолом
7. Оценка концентрации ДНК спектрофотометрическим методом (94)
8. Методика выделения ДНК сорбцией на селикагеле по Boom (24)
9. Методика проведения реакции амплификации
9.1. Состав реакционной смеси, условия амплификации
9.2. «Горячий старт»
10. Методика проведения электрофореза в агарозном геле
11. Методика определения говядины в образцах методом ИФА
ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Выбор олигонуклеотидных праймеров для дифференциальной амплификации ДНК говядины и баранины
2. Изучение специфичности выбранных праймеров
3. Подбор условий ПЦР
3.1. Оптимизация температуры отжига специфических олигонуклеотидов (праймеров)
3.2. Подбор концентрации праймеров
3.3. Применение «горячего старта»
4. Определение чувствительности и специфичности выбранной системы амплификации
5. Подбор методов выделения (очистки) ДНК из муки
6. Внутренний контрольный образец (ВКО)
7. Отрицательные и положительные контрольные образцы

8. Состав разработанной тест-системы
9. Определение чувствительности и специфичности разработанной тест-системы
10. Сравнение чувствительности методов ПЦР и ИФА
11. Комиссионные испытания ПЦР-тест-системы «БИГ»
12. Изучение активности и стабильности ПЦР-тест-системы в зависимости от срока хранения
13. Эпизоотическая статистика при тестировании кормов на ДНК жвачных животных методом ПЦР в России
ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
РИСУНКИ
ТАБЛИЦЫ
ЛИТЕРАТУРА
ПРИЛОЖЕНИЯ

Тест-система, содержит ряд «know-how» позволяющих упростить анализ, снизить количество манипуляций и увеличить стабильность реактивов. Упрощены методика постановки ПЦР, нанесения амплификатов на агарозный гель, окраска геля бромидом эттидия. Реактивы, необходимые для проведения амплификации (праймеры, нуклеотиды, Taq-полимераза, буфер, Mg2+, вода для ПЦР) скомпонованы в ПЦР-смесь-1 и ПЦР-смесь-2. Исследователю не нужно смешивать отдельные реагенты, что значительно экономит время затрачиваемое на проведение анализа и снижает риск загрязнения реактивов. ПЦР-смесь-1 (праймеры и нуклеотиды) входит в состав тест-системы уже розлитой в ПЦР-пробирки для проведения одной реакции и покрытой сверху слоем воска, наличие которого обеспечивает проведение «горячего старта». Такая фасовка упрощает анализ, снижает риск контаминации и повышает стабильность ПЦР-смеси-1. Следует отметить, что ПЦР-смесь-2 помимо компонентов необходимых для проведения реакции (Taq-полимераза, буфер, Mg2+, вода для ПЦР) содержит лидирующий краситель ксиленцианол, что освобождает пользователя от необходимости смешивания амплификата с красителем пред внесением проб в лунки агарозного геля для последующего электрофореза. В состав ТБЕ-буфера введен флюоресцентный краситель (бромистый этидий), что упрощает проведение, электрофоретического анализа, ислючая стадию окрашивания геля после проведения электрофореза.
Возвращаясь к аналитическим характеристикам тест-системы, следует отметить, что при параллельном исследовании образцов рыбной и куриной муки содержавшей примесь мясокостной муки жвачных методами ПЦР и ИФА (коммерческий набор «Cortecs Diagnostics Limited», Великобритания) было установлено, что ГОДР-анализ обнаруживал 0,1% и более примеси мясокостной муки, в то время как ИФА метод выявлял только 50% примеси в куриной муке и не выявлял 50% примеси в рыбной. При обнаружении примеси тканей жвачных в составе кормов чувствительность ПЦР была в 100 раз выше, чем ИФА.
Комиссионные испытания разработанной тест-системы и тест-систем основанных на методах ИФА (ВНИИЗЖ, г.Владимир) и реакции КП (ВНИВИ, г.Казань), проведенные согласно приказу Департамента ветеринарии Минсельхозпрода РФ № 15 от 15.04.99 г. показали непригодность тест-системы на основе метода КП, как давшей ложноотрицательный результат с 100% мясокостной мукой и ложноположительный с 100% чистой кукурузной, и ИФА-тест-системы как давшей ложноположительные результаты с 100% куриной и кукурузной мукой, смесями 50 и