Создание и биофармацевтическое обоснование термочувствительной липосомальной лекарственной формы доксорубицина

• Автор: Тазина, Елизавета Владимировна
• Шифр специальности: 14.04.01
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 204 с. : 43 ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Липосомы

1.1.1. Строение липосом

1.1.2. Свойства липосом

1.1.3. Методы получения липосом

1.1.4. Контроль качества липосомальных препаратов

1.1.5. Стабильность липосом

1.1.6. Методы загрузки лекарственных препаратов в липосомы
1.1.7. Применение липосом в биологии и медицине
1.2. Селективная доставка препаратов в опухоль с помощью термочувствительных липосом и локальной гипертермии
1.2.1. Особенности микроциркуляции в опухоли
1.2.2. Эффект повышенной проницаемости и удерживания как основа нацеливания липосом на опухоль
1.2.3. Гипертермия как компонент комбинированного лечения
1.2.4. Доксил и локальная гипертермия
1.2.5. Термочувствительные липосомы в комбинации с локальной гипертермией
1.2.6. Воздействие термочувствительных липосом с доксорубицином на опухолевые сосуды
1.2.7. Термочувствительные липосомы с пролонгированным временем
циркуляции
1.2.8. Термочувствительные липосомы и магнитно-резонансная термометрия
1.2.9. Термочувствительные полимеры и термолипосомы
1.3. Антрациклиновые антибиотики
1.3.1. Доксорубицина гидрохлорид
1.3.2. Липосомальные лекарственные формы доксорубицина
Заключение
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 2. Материалы и методы исследований
2.1. Материалы
2.2. Модели экспериментальной химиотерапии
2.3. Оборудование
2.4. Статистический анализ полученных результатов
2.5. Методы исследований
2.5.1. Получение термолипосомальной дисперсии с инкапсулированным доксорубицином
2.5.2. Стерилизация термолипосомальной дисперсии с доксорубицином
2.5.3. Получение лиофилизироваиных термолипосом с доксорубицином
2.5.4. Измерение диаметра везикул
2.5.5. Очистка термолипосом от не включившегося в везикулы доксорубицина
2.5.6. Количественное определение содержания доксорубицина в термолипосомах
2.5.7. Применение метода тонкослойной хроматографии для качественного анализа термолипосомального доксорубицина

2.5.8. Изучение перекиского окисления липидов, входящих в состав
термолипосомального доксорубицина
2.5.9. Изучение противоопухолевой активности термочувствительной липосомальной
лекарственной формы доксорубицина in vitro и in vivo
Заключение
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Глава 3. Разработка методик химико-фармацевтического анализа термолипосомального доксорубицина
3.1. Разработка методики спектрофотометрического определения содержания доксорубицина в термолипосомальной лекарственной форме
3.1.1. Изучение характера поглощения электромагнитного излучения субстанцией доксорубицина и термолипосомальным доксорубицином в УФ- и видимой областях спектра
3.1.2. Выбор рабочей длины волны для количественного анализа
термолипосомального доксорубицина
3.1.3. Проверка соблюдения основного закона светопоглощения Бугера-Ламберта-
Бера
3.1.4. Изучение влияния вспомогательных веществ, входящих в состав лекарственной формы, на спектральные характеристики доксорубицина
3.1.5. Изучение стабильности доксорубицина в растворах для
спектрофотометрического анализа
3.1.6. Определение удельного показателя поглощения доксорубицина в спиртовом растворе
3.1.7. Количественное определение содержания доксорубицина в
свежеприготовленной термолипосомальной дисперсии
3.1.8. Аналитические характеристики методики количественного определения
содержания доксорубицина в термолипосомах
3.2. Разработка методик хроматографического определения компонентов, входящих
в состав термочувствительной липосомальной лекарственной формы
доксорубицина
3.2.1. Разработка методики хроматографического определения доксорубицина в термолипосомальной лекарственной форме
3.2.2. Разработка методики хроматографического определения липидов и доксорубицина в термолипосомальной лекарственной форме
3.2.3. Разработка методики хроматографического определения сахарозы в термолипосомальной лекарственной форме
3.3. Изучение перекисного окисления липидов, входящих в состав термолипосом
Заключение
Глава 4. Оптимизация технологии получения и состава термолипосомального доксорубицина
4.1. Получение и анализ термолипосомального доксорубицина с криопротектором сахарозой
4.2. Оптимизация технологии получения термолипосомального доксорубицина с
соответствующим криопротектором
4.2.1. Изучение влияния формообразователя коллидона на размеры везикул и включение доксорубицина в термолипосомы

4.2.2. Изучение влияния различных криопротекторов на размеры везикул и
включение доксорубицина в термолипосомы
4.3. Выбор оптимального состава термолипосомального доксорубицина
4.3.1. Изучение влияния липидного состава термолипосом на их размеры и
включение доксорубицина
4.3.2. Выбор оптимального соотношения препарат : суммарные
липиды для загрузки доксорубицина в термолипосомы
4.4. Изучение влияния концентрации липидов и доксорубицина в
термолипосомальной дисперсии на размеры везикул и включение препарата
4.5. Изучение влияния размеров термолипосом на включение доксорубицина
4.6. Разработка методики очистки термолипосомального доксорубицина от не включившегося в везикулы препарата на хроматографической колонке
4.6.1. Изучение процесса гель-фильтрации термолипосомального
доксорубицина на колонке С 10/20
4.6.2. Оценка качества набивки хроматографической колонки С 10/20
4.6.3. Сравнение фракционирующей способности хроматографических
колонок NAP-5 и С 10/20 при очистке термолипосомального доксорубицина
4.6.4. Выбор длины волны на детекторе UVis-920 для контролирования процесса очистки термолипосомального доксорубицина с помощью колонки С 10/20
4.7. Изучение влияния стерилизующей фильтрации на количественное содержание
доксорубицина и эффективность его включения в термолипосомы
Заключение
Глава 5. Получение, стандартизация и изучение стабильности
лиофнлизированного термолипосомального доксорубицина
5.1. Разработка режима лиофилизации термолипосомального доксорубицина
5.1.1. Определение температуры замораживания термолипосомального доксорубицина
5.1.2. Выбор способа замораживания и сублимационной сушки
термолипосомального доксорубицина
5.1.3. Влияние продолжительности замораживания на качество готового продукта
5.1.4. Изучение стабильности термолипосомальной дисперсии доксорубицина при температуре -18 °С
5.1.5. Оптимизация режима сублимационной сушки термолипосомального доксорубицина
5.1.6. Наработка серий лиофилизированного термолипосомального доксорубицина
для химико-фармацевтических исследований
5.2. Изучение влияния различных физико-химических факторов на включение доксорубицина в лиофилизированные термолипосомы и размеры полученных везикул
5.2.1. Изучение влияния растворителей для регидратации на включение доксорубицина в лиофилизированные термолипосомы и размеры везикул
5.2.2. Изучение влияния времени регидрагации лиофилизата на включение доксорубицина в термолипосомы
5.2.3. Изучение влияния буфера для получения термолипосом на включение доксорубицина в лиофилизированные везикулы и размеры частиц
5.3. Стандартизация лиофилизированной термолипосомальной лекарственной формы доксорубицина

градиенту, может эффективно применяться для лечения опухолей, в которых значение pH ниже, чем в здоровых тканях.
1.1.6.7. Физическое состояние доксорубицина внутри липосом
Cullis, Harrigan, Madden, Mayer et al. изучали физическое состояние доксорубицина, загруженного в липосомы с использованием нитратного буфера для создания трансмембранного pH-градиента. Хотя изначально ученые предположили, что цитрат способствует образованию преципитатов инкапсулированного доксорубицина [200, 214], в более поздней работе они отметили, что наблюдавшееся ослабление сигнала ЯМР препарата происходило из-за его связывания с внутренней поверхностью липосом [143]. Кроме того, обнаруженные посредством криоэлектронной микроскопии структуры внутри везикул с доксорубицином [98] они объясняли проникновением препарата в липосомальную мембрану. Li et al. [194] заметили, что доксорубицин формирует преципитаты в растворах, содержащих цитрат (рис. 6), поэтому целью их работы стало дальнейшее исследование физического состояния доксорубицина, загруженного в везикулы, состоявшие из EPC/Chol, с помощью трансмембранного pH-градиента. Используя криогенную электронную микроскопию, они установили, что препарат при внутрилипосомальной концентрации 200-300 мМ образовывал с цитратом линейные, изогнутые и круглые пучки волокон без существенных взаимодействий/нарушений мембраны везикул (рис. 7). Волокна доксорубицина также образовывались при внутрилипосомальной концентрации приблизительно 20 мМ, что указывало на относительно низкий концентрационный порог, при котором формируются эти структуры. Также отмечалось, что в везикулах цитрат-ион соединяет соседние волокна в пучки под действием электростатических сил.
Рис. 6. Конфокальная световая микроскопия пучков волокон цитрата доксорубицина.
Водный раствор доксорубицина смешивали с цитратным буфером в соотношении 1:1 для получения конечной концентрации препарата 4 мМ, а цитрата - 300 мМ (pH 4). Похожие агрегаты доксорубицина наблюдали в цитратном буфере с pH 5 и в растворе сульфата аммония при pH 4 и 7. Масштаб изображения - 5 мкм [194].