Экспрессия теломеразы в иммунокомпетентных клетках человека в норме и при иммунопатологических состояниях

• Автор: Королькова, Ольга Юрьевна
• Шифр специальности: 14.03.09
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 120 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Теломераза человека и ее регуляция

1.1. Роль теломеразы в проблеме концевой недорешшкацшт хромосом

1.2. Состав теломеразного комплекса

1.2.1. Каталитическая субъединица теломеразы

1.2.2. РНК-субъединица теломеразы

1.3. Регуляция активности теломеразы

1.3.1. Транскрипционная регуляция hTERT
1.3.2. Посттранскрипционная регуляция теломеразы
Глава 2. Механизмы регуляции теломеразы в норме и при патологии
2.1. Регуляция теломеразы в иммунокомпетентных клетках человека
2.1.1. Лимфоидные клетки
2.1.2. Миелоидные клетки
2.2. Теломераза при различных иммунопатологических состояниях
2.2.1. Активность теломеразы при ревматоидном артрите
2.2.2. Активность теломеразы при системной красной волчанке
2.2.3. Активность теломеразы при рассеянном склерозе
2.2.4. Активность теломеразы при атопическом дерматите и псориазе
2.2.5. Активность теломеразы при апластической анемии
ЧАСТЬ И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
ЧАСТЬ III. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Глава 1. Постановка метода оценки мРНК hTERT в имунокомпетентных клетках с
помощью Flow-FISH
1.1. Проверка специфичности используемого PNA зонда
1.2. Разработка условий гибридизации in situ
1.2.1. Выделение и подготовка клеточных образцов
1.2.2. Денатурация нуклеиновых кислот
1.2.3. Г ибридизация
1.2.4. Удаление не связавшегося зонда из клеток
1.2.5. Окрашивание ДНК
1.2.6. Запись и анализ данных

1.2.7. Воспроизводимость метода Flow-FISH
1.3. Демонстрация метода гибридизации in situ
Глава 2. Экспрессия теломеразы в интактных и стимулированных лимфоцитах
человека в норме и при иммунопатологических состояниях
2.1. Экспрессия мРНК hTERT в интактных лимфоцитах
2.2. Содержание субъединицы hTERT в интактных лимфоцитах
2.3. Экспрессия мРНК hTERT в стимулированных лимфоцитах
2.4. Содержание hTERT в стимулированных лимфоцитах
2.5. Содержание hTERT и мРНК hTERT в CD4 и CD8 субпопуляциях лимфоцитов
2.6. Исследование активности теломеразы в лимфоцитах при поликлональной
стимуляции
ОБСУЖДЕНИЕ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АА - апластическая анемия
АД - атопический дерматит
АПК - антиген-представляющая клетка
БА - бронхиальная астма
ВЭБ - вирус Эпштейн-Барра
ГЦ - герминальный центр
ЗФР - забуференный физиологический раствор
МНК - мононуклеарные клетки
ПК - периферическая кровь
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РА - ревматоидный артрит
РНП - рибонуклеопротеин
PC - рассеянный склероз
СКВ - системная красная волчанка
СКК - стволовая кроветворная клетка
ФГА - фитогемагглютинин
ЭДТА - зтилендиаминтетрауксусная кислота
7-AAD - 7 аминоактиномицин D (7 aminoactinomycin D)
BSA - бычий сывороточный альбумин (bovine serum albumin)
CD - кластер днфференцировки (cluster of differentiation)
DAPI - 4',6-диамидино-2-фенилиндол (4',6-diamidino-2-phenylindole)
DMSO - диметил сульфоксид (dimethyl sulfoxide)
FBS - фетальная бычья сыворотка (fetal bovine serum)
FITC - флуоресцетга изотиоцианат (fluorescein isothiocyanate)
FISH - флуоресцентная in situ гибридизация (fluorescent in situ hybridization)
FL - канал флуоресценции (flowline)
FSC - параметр прямого светорассеяния (forward angle light scatter)
hTERT - каталитическая субъединица теломеразы человека (human telomerase reverse
transcriptase)
hTR - теломеразная РНК человека (human telomerase RNA)

процесса дифференцировки всех представителей миелоидного ростка [Weng N., 2001].
2.2. Теломераза при различных иммунопатологических состояниях
В лимфоцитах периферической крови уровень активности теломеразы довольно низок, но возрастает в результате стимуляции, как антиген-зависимой. так и поликлональной, и поэтому может служить показателем их нахождения в активированном и/или пролиферирующем состоянии. С учетом этого, некоторые исследования посвящены изучению роли теломеразы в патогенезе ряда аутоиммунных заболеваний, связанных с нарушением гомеостаза иммунокомпетентных клеток, и в особенности Т лимфоцитов [Andrews N.P.,2010], Наиболее подробно изучено содержание теломеразы при таких аутоиммунных заболеваниях, как ревматоидный артрит [HiyamaE., 1998, Fujii H., 2009, Yamanishi Y., 1998, Yudon K., 1999], системная красная волчанка [Katayama Y., 2001, Kurosaka D., 2003, Klapper W., 2004, Tarhan F., 2008], атопический дерматит [Wu K., 1999, Wu K., 2000], псориаз [Wu K., 2000], рассеянный склероз [Katayama Y., 2001, Tarhan F ., 2008].
2.2.1. Активность теломеразы при ревматоидном артрите
Ревматоидный артрит является аутоиммунной патологией, характеризующейся хроническими воспалительными процессами. По мере увеличения длительности заболевания РА появляются дефекты фенотипа и функциональной активности Т лимфоцитов, как-то: развивается гипореактивность, становится меньше количество наивных CD4+ клеток и сокращается нормальный наивный репертуар TCR одновременно с клональной экспансией части Т лимфоцитов [Thewissen М., 2005]. За активацию и пролиферацию клеток при РА может быть ответственна, по крайней мере частично, теломераза. Возможно, гиперплазия хрящевой ткани при РА происходит вследствие активации клеточного деления, связанного именно с экспрессией теломеразы.
Активность теломеразы присутствует на высоком уровне в МНК и лимфоцитах, инфильтрирующих синовиальную оболочку пациентов с РА, причем активность теломеразы в синовиальных CD4+, CD 19+ и CD45RO+ лимфоцитах превышает активность в соответствующих лимфоцитах периферической крови [Yudon K., 1999]. Большинство синовиальных инфильтрирующих лимфоцитов - это