Эпидемиологическая характеристика лихорадки Западного Нила и молекулярно-генетические особенности изолятов, циркулирующих на территории Волгоградской области

• Автор: Жуков, Кирилл Вадимович
• Шифр специальности: 14.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 105 с. : 29 ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы исследования
Степень научной разработанности темы
Цель работы:
Задачи исследования:
Научная новизна:
Теоретическая и практическая ценность:
Методология и методы исследования:
Положения выносимые на защиту:
Структура и объем диссертации
Глава 1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. История и географическое распространение ЛЗН
1.1.1 .Распространение и эпидемиологическая характеристика ВЗН на Африканском континент
1.1.2.Эпидемиологические особенности распространения ВЗН на территории США
1.1.3 .Проникновение вируса лихорадки Западного Нила в Европу и Россию
1.2. Таксономия и молекулярно-биологическая характеристика ВЗН
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Методы эпидемиологического анализа
2.2. Штаммы вируса лихорадки Западного Нила, использованные в работе
2.3. Сбор, транспортировка, хранение и подготовка исследуемого материала
2.4. Молекулярно-биологические и иммунодиагностические методы
2.5. Компьютерный анализ секвенированных последовательностей
2.6. Используемые в работе компьютерные программы
Глава 3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Анализ вспышек лихорадки Западного Нила в Волгоградской области

3.1.1. Природно-климатические условия Волгоградского региона
3.1.2. Резервуар инфекции. Основные пути миграции
3.1.3 Основные переносчики ВЗН
3.1.4. Особенности клинического течения ЛЗН
3.1.5. Условия формирования природных очагов вируса ЛЗН
3.2. Пространственный эпидемиологический анализ территории Волгоградской области, отражающий степень риска заражением ЛЗН
3.3. Исследование полевого и клинического материала
3.3.1. Результаты исследования на наличие РЖ ВЗН материала полученного от птиц
3.3.2. Данные мониторинга за возбудителем ЛЗН в основных переносчиках
3.3.3. Исследование клинического материала поступившего от больных, доноров и реконвалесцентов
3.4. Молекулярно-генетический анализ геномов ВЗН
3.4.1. Сравнительный анализ геномов с использованием специализированного программного обеспечения
3.4.2. Разработка олигонукпеотидных праймеров для идентификации всех генотипов ВЗН94
3.4.3.Определение генотипической принадлежности вируса выделенного из анализируемых проб с использованием метода секвенирования
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Приложение
ВВЕДЕНИЕ
Арбовирусные инфекции в связи с их широким географическим распространением, видовым многообразием и тяжестью клинического течения привлекают к себе особое внимание здравоохранения и медицинской науки во всем мире. Лихорадка Денге (тропические и субтропические регионы Азии, Африки, страны Средиземноморья, Центральной и Южной Америки, Австралии); энцефалит Сент-Луис (Американский континент), особо опасная инфекционная болезнь — желтая лихорадка (Африка, Южная Америка), весенне-летний клещевой энцефалит (Евразия), японский энцефалит, клещевой шотландский энцефалит овец, Омская геморрагическая лихорадка нередко вызывают тяжелые заболевания не только у людей, в некоторых случаях с летальным исходом, но и у животных, многие из которых являются резервуаром поддерживающим циркуляцию вирусов в окружающей среде [10, 11, 44, 138]. Не только новые, ранее неизвестные арбовирусные инфекции, но и давно изученные, способны вызывать ежегодные спорадические случаи заболевания и эпидемии. Наиболее значимой арбовирусной инфекцией для Волгоградского региона является лихорадка Западного Нила, возбудителем которого является вирус Западного Нила. ЛЗН относится к арбовирусным болезням, передающихся посредствам укусов комаров, клещей и москитов, питающихся главным образом на птицах водно- или околоводного комплекса.
Основным резервуаром в природе для ЛЗН являются многие виды птиц. Главным образом водно-околоводного комплекса и кормящиеся на земле [3]. Несмотря на то, что штаммы вируса ЛЗН неоднократно были выделены от млекопитающих животных, мышевидных грызунов, зайцев, коров, лошадей, лемуров, собак, уровень вирусемии в крови остается достаточно низким, в связи с чем, их роль в поддержании вируса в природе является не столь значимой по сравнению с птицами [82, 93]. ВЗН способен перемещатся на значительные расстояния с участием перелетных птиц, что обуславливает возможность

после электрофореза фрагментов ДНК необходимого размера. Размер амплифицированных фрагментов ДНК подтверждали по их положению по отношению к маркерным фрагментам (100 - 1000 п.н. DNA Ladder, ЦНИИ Эпидемиологии, Москва). Для документирования полученных результатов гелевые пластинки сканировали с помощью системы получения изображений «GelDoc XR» («BioRad», США).
Очистку специфических ампликонов проводили стандартными методами [23]. Измерение концентрации специфических продуктов амплификации производили с помощью прибора Qubit 2.0 («Invitrogen», Австрия), используя комплект реагентов Qubit Assays.
Для постановки реакции секвенирования использовали набор BigDye Terminator vl.l Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США). Для очистки продуктов реакции терминирования использовался комплект BigDye XTerminator Purification Kit (Applied Biosystems, США). Определение последовательностей нуклеотидов проводилось с помощью автоматического секвенатора ABI Prism 3130 (Applied Biosystems, США). Продукты секвенирования были представлены в виде текстовых и графических файлов программы ABI Sequensis Analysis 5.2 for Windows (Applied Biosystems, США).
Для проведения иммунодиагностических исследований применяли тест-системы «Векто-НИЛ-IgG», «BeKToHHJT-IgG-авидность» (ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск), «Anti-West Nile Virus ELISA (IgM)», «Anti-West Nile Virus ELISA (IgG)», «Avidity Anti-West Nile Virus (IgG) ELISA» («Euroimmun AG», Германия) и «ЗН-IgM» («Биосервис», г. Боровск). Расчет % индекса авидности (НА) IgG осуществляли на основании тест-системы «ВектоНИЛ-С-авидность» (ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск) и ИФА на планшетах «Avidity Anti-West Nile Virus (IgG) ELISA» («Euroimmun AG», Германия).
Молекулярно-генетические и иммунодиагностические исследования проведены совместно с сотрудниками лаборатории генной диагностики и типирования микроорганизмов и группой иммунологических исследований Референс-центра по мониторингу за возбудителем лихорадки Западного Нила на