Изменения актинового цитоскелета и динамики клеточного края, определяющие характер клеточной миграции трансформированных фибробластов

• Автор: Ломакина, Мария Евгеньевна
• Шифр специальности: 14.01.12
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 145 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Цели и задачи исследования

Научная новизна и практическая ценность работы

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Организация актинового цитоскелета фибробластов

1.1. Актин — основной белок микрофиламентов

1.2. Белки, индуцирующие полимеризацию актина

1.3. Белки, ассоциированные с актином

1.4. Распределение актина в подвижной клетке (фибробласте)
1.5. Зональность организации актина на акгивном крае движущегося фибробласта
1.6. Взаимодействие актинового цитоскелета с фокальными контактами
1.7. Регуляция перестроек актинового цитоскелета и клеточного движения
1.7.1. Малые ГТФазы семейства Rho
1.7.2. Семейство WASP
2. Цитоскелет, морфология, и движение трансформированных фибробластов
2.1. Способы миграции трансформированных клеток
2.1.1. Коллективная миграция
2.1.2. Мезенхимальный способ миграции
2.1.3. Амебоидный способ миграции
2.1.4. Пластичность, как свойство опухолевых клеток
2.2. Нарушение структуры и функции актиновых пучков и фокальных контактов
2.3. Образование специфических мембранных структур
2.4. Регуляция миграции трансформированных клеток
3. Описание используемых в работе моделей трансформации
3.1. Ras-трансформация
3.2. Трансформация клеток вирусом SV
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Клеточные культуры
2. Иммуноблоттинг
3. Флуоресцентное окрашивание и микроскопия
4. Прижизненное наблюдение и микрофотосъемка
5. Анализ характера псевдоподиальной активности
6. Морфометрический анализ клеточной формы
7. Исследование клеточной миграции
8. Конфокальная микроскопия и методы обработки полученных результатов
9. Платиновые реплики и электронная микроскопия
РЕЗУЛЬТАТЫ
ГЛАВА 1. Ras-трансформация
1.1. Морфологическое описание исследуемых клеточных культур 10(3) и 10(3)RAS
1.2. Строение актинового цитоскелета и ассоциированных с ним структур у контрольных и Ras-трансформированных фибробластов
1.3. Распределение и характер псевдоподиальной активности
1.4. Исследование динамики ведущего активного края контрольных и Ras-трансформированных фибробластов

1.5. Анализ локомоторного поведения контрольных и Ras-трансформнрованных
фибробластов
ГЛАВА 2. 8У40-трансформация
2.1. Морфологическое описание клеточных культур MRC-5, MRC-5V1 и MRC-5V2
2.2. Строение актинового цитоскелета и ассоциированных с ним структур у контрольных и 8У40-трансформированных фибробластов
2.3. Распределение и характер псевдоподиальной активности
2.4. Исследование динамики ведущего активного края контрольных и SV40-трансформированных фибробластов
2.5. Ультраструктура актинового цитоскелета на краю клетки у контрольных и 8У40-трансформированыых фибробластов
2.6. Анализ локомоторного поведения контрольных и 8У40-трансформированных фибробластов
ГЛАВА 3. Исследование трансформации на модели линии фибросаркомы человека НТ-1
3.1. Морфологическое описание исследуемых клеточных культур
3.2. Строение актинового цигоскелета и ассоциированных с ним структур у контрольных подкожных фибробластов и клеток фибросаркомы НТ-1080
3.3. Распределение и характер псевдоподиальной активности
3.4. Исследование динамики ведущего активного края контрольных фибробластов и клеток фибросаркомы НТ-1
3.5. Анализ локомоторного поведения контрольных подкожных фибробластов и клеток фибросаркомы НТ-1
ОБСУЖДЕНИЕ
1. Изменение актинового цитоскелета фибробластов при трансформации и его эффект на морфологию клетки
2. Перераспределение и реорганизация псевдоподиальной активности в результате трансформации
2.1. Отсутствие “истинно стабильного” клеточного края у трансформированных фибробластов и изменение ультраструктуры актинового цитоскелета
2.2. Характерные изменения в динамике активного края трансформированных клеток
3. Изменение локомоторного поведения фибробластов в результате трансформации:
приобретение способности к «поисковому» движению и инвазии
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АДФ - аденозиндифосфат АТФ - аденозинтрифосфат ГДФ - гуаназиндифосфат ГТФ - гуаназинтрифосфат РУ - ретрактирующие участки САУ - сильноактивные участки СлАУ - слабоактивные участки СтУ -стабильные участки
ADF - actin depolimerasing factor I/
VII‘1 - actin-interacting protein
Arp2/3 - actin-related protein 2/
Cdc42 - cell division cycle
DIC - differential-interferential contrast
DMEM - Dulbecco’s modified Eagle’s medium
ECM - extracellular matrix
FA - focal adhesions
FAK - focal adhesion kinase
FCS - fetal calf s serum
GAP - GTPase activating protein
GEF - GTP exchange factors
G-protein — guanine nucleotide binding protein
LPA - lysophosphate acid
LT - large Tumor-antigen
МАРК - MAP (mitogen-activated protein)-kinase
MLCK - myosin light chain kinase
MMP2 - matrix metalloprotease
N-WASP - neural Wiskott-Aldrich syndrome protein
PBS - phosphate buffer solution
PDGF -platelet derived growth factor
PFA - paraform-aldehyde
PIP3 - phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphate
PP2A - protein phosphatase 2A
qFSM - quantitative fluorescent speckle microscopy

свои эффекторы и, как следствие, вызывать стимуляцию размножения, повышение жизнеспособности (Downward, 1998) и изменения морфогенетических реакций клеток, резко увеличивая тем самым вероятность образования из них опухолей (для опухолевых клеток характерны генетические изменения компонентов передачи митогенных сигналов). В связи с этими свойствами гены ras относят к группе протоонкогенов, т.е. генов, усиление экспрессии или модификация функции которых приводит к развитию новообразований.
Влияния активации Ras на цитоскелет
Разберем подробнее сигнальный путь, одним из результатов возможной активации которого при Ras-индуцированной трансформации является активация малой ГТФазы Rac и индукция перестроек актинового цитоскелета (см. рис 4). Этот путь индуцируется через активацию PI3K (phosphatidylinositol 3-kinase). Ras связывается непосредственно с каталитической субъединицей PI3K, что ведет к ее транслокации на плазматическую мембрану и конформационным изменениям, вызывающим активацию PI3K. Ее активная форма фосфорилирует PI(4,5)P2 (phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate) с образованием PI(3,4,5)P3 (phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate) — вторичного мессенжера, активирующего множество мишеней, наиболее важными из которых являются Rac и киназы PDK1 (3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1) и АКТ(РКВ). Ras-индуцированпая активация Racl стимулирует Агр2/3-зависимую полимеризацию актина на периферии клетки и образование ламеллиподии (Burridge and Wennerberg, 2004) и раффлов (Yamazaki et al., 2005). Стимуляция PDK1, в свою очередь, играет решающую роль в активации большого семейства AGC-киназ, включающих АКТ/РКВ - сильный анти-апоптотический агент, который принимает непосредственное участие в повышении жизнеспособности клетки (Downward, 2002).
В недавних исследованиях показано, что экспрессия активированного Ras таюке подавляет сигнальный путь Rho-ROCK-LIMK и приводит к увеличению содержания дефосфорилированного кофилина, что, в свою очередь, индуцирует деполимеризацию F-актина (DesMarais et al., 2005).
Наиболее заметным нарушением актинового цитоскелета в трансформированных онкогеном ras клетках является дефектность или отсутствие стресс-фибрилл (Nobes and Hall, 1995; Ridley and Hall, 1992). Возможно, это происходит вследствие снижения экспрессии различных актин-связывающих белков, таких как а-актинин, гельзолин, профилин, винкулин, тропомиозин и т.д (Gluck et al., 1993; Tanaka et al., 1995; Rodriguez-