Генетические факторы предрасположенности к курению

• Автор: Митюшкина, Наталья Владимировна
• Шифр специальности: 14.01.12
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 115 с. : ил.

Оглавление

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ТЕРМИНОВ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Распространённость курения табака и факторы риска

1.2 Генетические факторы, связанные с курением

1.3 Гены системы дофаминергической нейротрансмиссии

1.4 Функции дофамина и структуры головного мозга, с ними связанные

1.5 Функциональные полиморфизмы генов системы дофаминовой нейротрансмиссии, ассоциации их с курением
1.6 Психологические особенности и психиатрические патологии, ассоциированные с курением

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2 Л Материалы
2.2 Исследуемые группы
2.3 Выбор полиморфизмов для исследования
2.4 Выделение ДНК
2.5 Генотипирование
2.6 Статистический анализ данных
3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1 Характеристики изучаемых групп
3.2 Соответствие распределения генотипов закону Харди-Вайнберга
3.3 Проверка гипотезы о связи изучаемых полиморфизмов со статусом курения
3.4 Наиболее вероятные генетические факторы, влияющие на статус курения
3.5 Связь изучаемых полиморфизмов со степенью никотиновой зависимости
3.6 Эпистатическис взаимодействия изучаемых полиморфизмов
3.7 Ассоциации полиморфизмов в гене ОА'П с различными характеристиками курильщиков
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ 1. Содержание анкет

Список используемых сокращений и терминов
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ПДРФ анализ - анализ методом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов
ПДАФ анализ - анализ методом полиморфизма длин амцлифицированных фрагментов
КОМТ - катехол-О-метилтрансфераза
СДВГ - синдром дефицита внимания с гиперактивностью
цАМФ - циклический аденозинмонофосфат
ДОФА - дигидроксифенилаланин

Введение
Актуальность проблемы
Курение является фактором риска для многих сердечно-сосудистых, бронхо-лёгочных и онкологических заболеваний, и вносит значительный вклад в смертность от них. Рак лёгкого, благодаря распространению табакокурения в XX веке, сейчас находится на первом месте по частоте среди онкологических заболеваний. До 90% всех случаев рака лёгкого обусловлено курением [1].
Целью антитабачной политики, проводимой многими странами, является снижение заболеваемости и смертности от патологий, связанных с курением. Предупреждение инициации курения, особенно среди подростков, а также мотивация курильщиков к отказу от курения и оказание им н этом соответствующей помощи - основные направления такой политики. Но несмотря на значительные успехи в борьбе с курением в первые годы проведения антитабачных кампаний, процент курящих даже в развитых странах остаётся довольно высоким [1]. При этом почти все курящие осведомлены о губительном воздействии курения табака на здоровье. И всё же большое количество людей продолжает курить или начинает курить заново. Поэтому установление причин, заставляющих людей принимать то или иное решение в отношении курения, является на сегодняшний день весьма актуальной задачей.
В исследованиях на близнецах была установлена высокая степень наследственной предрасположенности к курению [2,3]. Однако, какие гены и полиморфизмы являются субстратом для этой предрасположенности, до сих пор не вполне ясно. Достаточно давно была высказана мысль о значении дофаминергической нейротрансмиссии для развития разных видов зависимости. Функциональная недостаточность дофаминергической нейропередачи может служить нейрохимической основой синдрома дефицита удовольствия — состояния, характеризующегося высоким порогом эмоционального реагирования на естественные вознаграждающие стимулы, и способствующего зависимости [4]. Полиморфизмы генов, продукты которых регулируют дофаминергическую нейротрансмиссию, могут быть факторами, регулирующими функциональную активность системы вознаграждения и модифицирующими предрасположенность к развитию аддиктивных состояний (зависимостей).
Хотя предметом изучения настоящей работы стали преимущественно полиморфизмы генов дофаминергической системы, другие виды нейропередачи, такие как серотонинер-гическая, ГАМК-ергическая, глутаматергическая, также могут оказывать влияние на

Аллель-специфическая Г1ЦР в реальном времени проводилась в объёме 20 мкл. В состав реакционной смеси входили: 1 ед. “hot-start” Taq-полимеразы “Thermostar” («Син-тол», Москва), 2 мкл 10-кратного ПЦР-буфера для Taq-полимеразы, 2.5 mM MgCh, по 175 мкМ каждого из дезоксинуклеотидтрифосфатов (дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ) и по 180 нМ прямого и обратного праймеров, а также флюоресцентные красители: 1-кратный SYBR Green и флюоресцеин (FAM) в концентрации 8 нМ. Программа амплификации включала фазу активации полимеразы (95°С, 10 мин), за которой следовали 50 циклов, включающих последовательно сменяющие друг друга фазы денатурации (95°С, 15 сек.), отжига (65-68°С, 30 сек) и элонгации (72°С, 30 сек). Затем ПЦР-смесь нагревалась от 65°С до 95°С с интервалом в 0,3 градуса и одновременным измерением уровня флюоресценции в каждой точке для построения кривой плавления. ПЦР для каждого тестируемого образца проводилась в двух разных пробирках, в каждой из которых находился один из аллель-специфических праймеров в сочетании с общим праймером. Результаты ПЦР оценивались на основании ACt (разницы во времени пересечения кривыми амплификации порогового уровня флюоресценции) для этих двух пробирок. Анализ кривых плавления проводился с целью контроля специфичности продукта ПЦР-реакции.
ПЦР с использованием флюоресцентно-меченых зондов проводилась в объёме 20 мкл. В состав реакционной смеси входили: 1 ед. “hot-start” Taq-полимеразы “Thermostar” («Синтол», Москва), 2 мкл 10-кратного ПЦР-буфера для Taq-полимеразы, 2.5 mM MgCh, по 250 мкМ каждого из дезоксинуклеотидтрифосфатов и по 180 нМ прямого и обратного праймеров, а также по 135 нМ каждого из флюоресцентно-меченых зондов. Программа амплификации включала фазу активации полимеразы (95°С, 10 мин), за которой следовали 50 циклов, включающих фазы денатурации (95°С, 15 сек.) и синтеза (60-63°С, 1 мин). Анализ результатов ПЦР проводился на основании оценки разницы конечных значений флюоресценции красителей, включенных в используемые зонды.
Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов включал в себя этапы ПЦР-амплификации, рестрикции, и гель-электрофореза. ПЦР проводилась в объёме 10 мкл. В состав реакционной смеси входили: 0,5 ед. “hot-start” Taq-нолимеразы “Thermostar” («Синтол», Москва), 1 мкл 10-кратного ПЦР-буфера для Taq-полимеразы, 2.5 мМ MgCh, по 250 мкМ каждого из дезоксинуклеотидтрифосфатов и по 200 нМ прямого и обратного праймеров. Программа амплификации включала фазу активации полимеразы (95°С, 10 мин), и 40 циклов, состоящих из фаз денатурации (95°С, 20 сек.), отжига (57°С, 45 сек) и элонгации (72°С, 45 сек). Продукт ПЦР-реакции подвергался рестрикции под действием фермента Taq I (СибЭнзим, Новосибирск). Фрагменты ДНК, образовавшиеся в результате рестрикции разделялись при помощи электрофореза в 10% полиакриламидном геле. На-