Новые подходы к оценке функциональной активности лимфоцитов с помощью проточной лазерной цитометрии

• Автор: Бахус, Галина Олеговна
• Шифр специальности: 14.00.36
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 101 с.

Список принятых сокращений

АДФ - аденозиндифосфат

АТФ - аденозинтрифосфат

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДМСО - диметилсульфоксид

ИЛ - интерлейкин

ИФА - иммуноферментный анализ

ИФН - интерферон

КФСЭ - карбоксифлюоресцеин сукцинилмидил эфир

Кон А - конканавалин А

ЛПС - липополисахарид
МЛ - митоген лаконоса
ГЖС - полная культуральная среда
РНК - рибонуклеиновая кислота
СПИД - синдром приобретенного иммунодефицита
ФСБ - фосфатно солевой буфер
ЭДТА - этилендиаминтетраацетат
7-AAD - 7-аминоактиномицин D
BCECF-AM - 2,7-бис-(2-карбокси-этил)-5,6-карбокси-флюоресцеин
ацетокси-метиловый эфир
BrdU - бромодезоксиуридин
CD - кластер дифференцировки
CFDA - 5,6-карбоксифлюоресцеин диацетат
CFSE - карбоксифлюоресцеин сукцинилмидил эфир
DiO - З'.З'-диоктадецилоксакарбоцианин перхлорат
Dot Plot - точечный рисунок
ЕМА - этидиума моноазид
EthBr - этидиума бромид
Eth-D - этидиума гомодимер
FACS - флюоресцентно активированный клеточный сортировщик ГОА - флюоресцеин диацетат FITC - флюоресеин-5-изотиоцианат
Список принятых сокращений (продолжение)
FSC - прямое светорассеяние
Ig - иммуноглобулин
KIR - киллинг-ингибирующий рецептор
МНС - главный комплекс гистосовместимости
NK - нормальные киллеры
PCR - полимеразная цепная реакция
РЕ - фикоэритрин
РегСР - перидинхлорофил-протеин
PI - пропидиума йодид
SSC - боковое светорассеяние
SYTOX Green - цианиновый краситель с 3-мя полож. зарядами Th -Т-хелпер
TNF -фактор некроза опухоли YO-PRO - мономеры цианина
Оглавление
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Проточная цитометрия - современный инструмент лабораторных методов исследования
1.1.1 .История создания клеточных анализаторов
1.1.2.Принципы работы проточного цитометра
1.1.3. Современные технологии, связанные с развитием проточной цитометрии
1.2. Методы оценки цитотоксической активности
лимфоцитов
1.2.1. Виды цитотоксической активности лимфоцитов и подходы к ее измерению
1.2.2. Традиционные методы оценки клеточной циготоксичности, их характеристика
1.2.3. Витальные флюоресцентные красители для проточной цитометрии
1.2.4. Эволюция принципов оценки клеточной цитотоксичности с помощью проточной цитофлюориметрии
1.3. Методы оценки пролиферативной активности лимфоцитов
1.3.1. Обычные методы оценки пролиферативной активности лимфоцитов
1.3.2. CFSE - новый подход к оценке клеточной пролиферации с помощью проточной цитометрии
1.3.2.1. Анализ двухкратного разведения CFSE - показателя деления клеток
1.3.2.2. Изучение взаимосвязи пролиферации и дифференцировки лимфоцитов in vitro с помощью CFSE-разведений
1.3.2.3. CFSE в изучении миграции и пролиферации лимфоцитов in
vivo

радиоактивным способом. В этих случаях используют другие критерии антигенспецифнческого ответа - взаимодействие лимфоцитов с мечеными флюорохромом тетрамерами МНС+пегггид [17], синтез у-ИНФ, обнаруживаемого методом ELISPOT [81], методом проточной цитометрии [62].
Другим критерием пролиферации лимфоцитов является предшествующее этому процессу образование бластов. Лимфобласты имеют больший размер, крупное рыхлое ядро и увеличенную цитоплазму. Их можно отличить от покоящихся лимфоцитов под световым микроскопом и подсчитать процент бласттрансформации. На проточном цитофлюориметре бласгы будут отличаться своими светорассеивающими свойствами, а именно, увеличенным сигналом по FSC и незначительно по SSC. Однако критерий ненадежен, часто область покоящихся лимфоцитов плавно, без границы переходит в область бластов. Другим признаком бластов является повышенное прокрашивание их ядерными флюорохромами - PI, Hoest, BrdU[66], Более менее зарекомендовавший себя цитометрический метод оценки бласттрансформации лимфоцитов - с использованием бромдезоксиуридина, который добавляют также, как 3Н-тимидин в конце инкубации к живой культуре лимфоцитов. Он захватывается бластами и включается в РНК. Образцы анализируют на цитометре после окрашивания ФИТЦ-мечеными антителами к BrdU или регистрируют снижение включения бромистого этидия в лимфобласты после их пермеабилизации. Однако группа указанных методов не позволяет прямо количественно оценить число циклов деления, прошедших каждым лимфоцитом. Это стало возможным с помощью проточной цитометрии только после создания метода разведения красителя (CFSE или РКН26), прочно и длительно связывающегося с наивными лимфоцитами.