Разработка иммуноферментной тест-системы для обнаружения энтеротоксина типа C золотистого стафилококка в сыром молоке

• Автор: Нагорных, Алексей Михайлович
• Шифр специальности: 06.02.05
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 124 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

1 ВВЕДЕНИЕ
2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2. 1 История возникновения стафилококковых пищевых отравлений
2.2 Систематика и общие свойства стафилококков
2.3 Роль энтеротоксигенных стафилококков в этиологии клинического и субклинического мастита коров
2.4 Факторы, влияющие на накопление энтеротоксина S. aureus в молоке и продуктах животного происхождения
2.5 Физико-химические, биологические, антигенные и иммуногенные свойства стафилококковых энтеротоксинов
2.6 Получение и очистка стафилококковых энтеротоксипов, выделенных из культур S. aureus
2.7 Методы определения стафилококковых энтеротоксинов
3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1 Материалы и методы
3.2 Результаты исследований
3.2.1 Определение уровня контаминации молока и секрета вымени лактирующих коров золотистыми стафилококками
3.2.2 Выявление энтеротоксигенных штаммов S. aureus и определение типов энтеротоксинов
3.2.3 Подбор штамма S. aureus, питательных сред и условий культивирования для получения максимального количества энтеротоксина типа С
3.2.4 Получение энтеротоксина типа С золотистого стафилококка для иммунизации кроликов
3.2.5 Выбор оптимальной схемы иммунизации для получения антиэнтеротоксических стафилококковых сывороток
3.2.6 Получение иммуноглобулинов и конъюгата пероксидаза-
антиэнтеротоксические иммуноглобулины
3.2.7 Отработка параметров иммуноферментной тест-системы
3.2.8 Определение чувствительности и специфичности иммуноферментной тест-системы
3.2.9 Определение диагностической чувствительности разработанного иммуноферментного тест-системы в сравнении с референтной тест-системой
3.2.10 Разработка способа пробоподготовки для эффективного обнаружения энтеротоксина типа С в сыром молоке с помощью разработанного метода

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ
1 ВВЕДЕНИЕ

В современных условиях при непрерывном повышении загрязнения окружающей среды вопросы гигиены сырого молока и контроля его качества становятся приоритетными. Поэтому к высококачественному молоку может быть отнесено лишь то молоко, которое соответствует предъявляемым к нему требованиям не только по пищевой ценности и органолептическим показателям, но прежде всего по безопасности потребления (4, 5).
Среди микроорганизмов — возбудителей пищевых отравлений ведущее место по частоте выделения занимает золотистый стафилококк. Стафилококковые отравления возникают при употреблении разнообразных пищевых продуктов, например, молочных, мясных, кондитерских и кулинарных изделий, и являются результатом нарушения технологических режимов получения сырья, его переработки и реализации готовой продукции (14, 17, 23, 27, 46).
Стафилококковые интоксикации (стафилококковые токсикозы) — наиболее распространенные пищевые отравления, так как стафилококки являются са-профитами и широко распространены во внешней среде, включая и воздух помещений. Стафилококки относительно устойчивы к химическим и физическим факторам воздействия, что обусловливает их выживаемость в пищевых продуктах. Особенностью интоксикаций стафилококковой природы является то, что они возникают в результате воздействия на организм энтеротоксинов, а не живых микробных клеток (32, 33). Другими словами, термическая обработка продуктов убивает стафилококк, но не разрушает его токсины, и отравление наступает даже после длительного проваривания и прожаривания пищи. Это обстоятельство затрудняет выявление причин вспышек микробиологическими методами, заставляя прибегать к методам обнаружения энтеротоксинов (30, 70, 96, 100, 146).
Пищевые отравления, вызванные употреблением продуктов, зараженных

83,152, 160).
В случае прямого конкурентного метода к иммобилизованным антителам добавляют исследуемый антиген и антиген, меченный ферментом, которые конкурируют за центры связывания антител. Ферментативная активность, определяемая в растворе или на носителе после установления в системе равновесия, пропорциональна концентрации определяемого вещества. Для получения количественной информации система предварительно калибруется по стандартному препарату определяемого антигена. Конкурентный иммуноферментный метод для обнаружения энтеротоксинов имеет чувствительность 0,1-2,5 нг/мл (66, 83, 149, 158).
В случае простого сэндвич-метода исследуемый антиген реагирует с антителами, иммобилизированными на твердой фазе. После промывки в систему добавляются антитела, меченные ферментом, и после инкубации и удаления непрореагировавших компонентов измеряют ферментативную активность, добавляя к системе субстрат, подходящий для конъюгированного фермента. Для получения количественной информации система
предварительно калибруется по стандартному препарату определяемого антигена.
Меченный ферментом специфический компонент в конце проведения иммунной реакции находится в двух состояниях: связанном (в составе комплекса антиген-антитело) и свободном (не вступивший в реакцию его избыток). Количество образовавшихся комплексов, а тем самым и содержание определяемого вещества, оценивают по каталитической активности ферментной метки.
Особенностью «сэндвич»-метода является создание сложного иммунного комплекса, образованного двумя антителами и антигеном между ними. Условием одновременного связывания обоими антителами определяемого антигена является наличие двух антигенных детерминант (123, 127, 128, 150).