Адаптация вируса африканской чумы свиней, выделенного в Российской Федерации, к перевиваемым культурам клеток и изучение его биологических свойств

• Автор: Прудникова, Елена Юрьевна
• Шифр специальности: 06.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Покров
• Количество страниц: 138 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1Л Актуальность темы

1.2 Степень разработанности проблемы

1.3 Цель и задачи исследований

1.4 Научная новизна результатов исследований

1.5 Теоретическая и практическая значимость работы

1.6 Степень достоверности и апробация работы

1.7 Соответствие содержания диссертации паспорту научной 11 специальности

1.8 Публикации

1.9 Структура и объем диссертации
1.10 Основные положения диссертационной работы, выносимые 12 на защиту
1.11 Личный вклад автора в выполнение работы
2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1 Африканская чума свиней: общая характеристика болезни
2.1.1 Распространение, экономический ущерб
2.1.2 Эпизоотология
2.1.3 Биологические свойства вируса африканской чумы свиней
2.1.3.1 Строение вируса африканской чумы свиней
2.1.3.2 Таксономия вируса АЧС
2.1.3.3 Сероиммунологическая классификация и генотипирование 19 вируса АЧС
2.1.3.4 Сохраняемость во внешней среде и устойчивость к 20 химическим и физическим факторам
2.1.4 Патогенез
2.1.5 Клинические признаки и патологоанатомическая картина
болезни
2.1.6 Иммунитет и специфическая профилактика

2.1.7 Лабораторная диагностика
2.2 Культивирование вирусов
2.3 Адаптация вирусов
2.4 Культивирование вируса африканской чумы свиней в 33 первичных и перевиваемых линиях клеток
2.5 Заключение по обзору литературы
3 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1 Материалы и методы
3.1.1 Вирусы
3.1.2 Культуры клеток
3.1.3 Питательные среды, растворы, сыворотки и реактивы
3.1.4 Животные 4
3.1.5 Оборудование и расходные материалы
3.1.6 Выращивание перевиваемых культур клеток
3.1.7 Адаптация вируса АЧС к перевиваемым линиям клеток
3.1.8 Культивирование вируса африканской чумы свиней в 44 первичных культурах клеток
3.1.9 Определение инфекционной активности вируса АЧС
3.1.10 Постановка реакции гемадсорбции
3.1.11 Постановка реакции прямой и непрямой 45 иммунофлуоресценции
3.1.12 Постановка твердофазного иммуноферментного анализа
3.1.13 Метод микробляшек
3.1.14 Оценка патогенности и иммуногенности культуральных 47 вариантов вируса АЧС
3.1.15 Отбор проб крови
3.1.16 Получение сыворотки 4
3.1.17 Анализ генетической изменчивости вируса АЧС
3.2 Результаты исследований
3.2.1 Обоснование выбора штамма вируса африканской чумы
свиней

3.2.2 Обоснование выбора перевиваемых культур клеток
3.2.3 Адаптация вируса АЧС к перевиваемым линиям клеток
3.2.4 Оптимизация условий культивирования вируса АЧС в 57 перевиваемых линиях клеток
3.2.4.1 Определение оптимальной множественности заражения
3.2.4.2 Влияние pH среды на накопление вируса
3.2.4.3 Влияние концентрации сыворотки крови на накопление 59 вируса
3.2.4.4 Влияние возраста культуры клеток на накопление вируса 60 АЧС
3.2.5 Получение перевиваемой сублинии клеток А4С2/9К
3.2.6 Культивирование вируса АЧС штамм Ставрополь 01/08 в 63 перевиваемой культуре клеток А4С2/9к
3.2.7 Размножение вируса АЧС, адаптированного к клеткам 64 А4С2/9к в перевиваемых линиях клеток
3.2.8 Суспензионное культивирование вируса АЧС
3.2.9 Гемадсорбция в перевиваемой линии клеток А4С2/9к
3.2.10 Изучение чувствительности перевиваемой линии клеток 69 А4С2/9к к различным изолятам вируса АЧС
3.2.11 Постановка РЗГАд в перевиваемой культуре клеток А4С2/9к
3.2.12 Культуральные свойства вируса АЧС, адаптированного к 73 перевиваемым линиям клеток
3.2.12.1 Изучение цикла репродукции вируса АЧС в перевиваемых 73 линиях клеток
3.2.12.2 Цитопатические изменения
3.2.12.3 Влияние адаптации вируса АЧС к перевиваемым 76 культурам клеток на характер проявления гемадсорбции
3.2.12.4 Инфекционная активность
3.2.12.5 Антигенная активность
3.2.12.6 Бляшкообразующие свойства
3.2.13 Анализ вариабельных участков генома вируса АЧС

возникновения атипичных лимфоцитов является вирусиндуцированный синтез одновременно большого числа регуляторных цитокинов при инфицировании клеток [212]. Цитофотометрический анализ выявил, что под действием вируса АЧС в моноцитах, макрофагах и лимфобластах КМС, особенно на ранних стадиях инфицирования (24 ч), возрастает содержание ядерной ДНК. В лимфобластах этот эффект выражен и на более поздних стадиях инфекции (72ч) [52, 61, 134, 122, 191].
При культивировании вируса АЧС в клетках КМС или JIC наблюдают специфическую гемадсорбцию. Однако не все изоляты вируса АЧС обладают гемадсорбирующими свойствами [156, 184, 185]. В Португалии были выделены негемадсорбирующие менее вирулентные штаммы из легких свиней при хронической пневмонии. При пассировании их в культуре клеток не менее 50 раз гемадсорбция не восстанавливалась [109]. В ЮАР выделили негемадсорбирующий штамм от домашних свиней при естественной эпизоотии. Позднее там был выделен негемадсорбирующий вариант из суспензий клещей О. moubata, собранных в очагах инфекции [185]. Опубликованы данные о выделении негемадсорбирующих штаммов из гемадсорбирующих методом предельных разведений [119].
Существует несколько гипотез для объяснения появления негемадсорбирующих штаммов. Одни исследователи считают, что в природе существуют смешанные популяции негемадсорбирующих и гемадсорбирующих частиц, которые в процессе селекции дифференцируются [119], другие — что негемадсорбирующие штаммы являются мутантами вирулентных гемадсорбирующих штаммов [ 109].
Реакцию гемадсорбции в культурах клеток КМС, JTC, альвеолярных макрофагов используют для диагностики, определения серотипа, а также титрования вируса АЧС [56, 68]. Кроме того, культуру альвеолярных макрофагов используют для титрования вируса АЧС методом бляшек [171].
Однако получение первичных культур клеток КМС, ЛС является сложным технологическим процессом, а их чувствительность к вирусу