Динамика распределения и накопления вируса мозаики сои и активность пероксидазы и карбогидраз в различных по устойчивости сортах сои

• Автор: Андреева, Ирина Валентиновна
• Шифр специальности: 06.01.11
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Владивосток
• Количество страниц: 127 с. : ил.

Выражаю глубокую благодарность моему научному руководителю к.б.н. М. Е. Ладыгиной. Выражаю сердечную благодарность за всестороннюю помощь и поддержку в работе д.б.н., проф. В. И. Малиновскому, к.б.н., с.н.с. Н. Н. Какарека, к.б.н., с.н.с. М. В. Сапоцкому за критические замечания и проведение совместных экспериментов с вирусами, д.х.н., вед.н.с. Т. Н. Звягинцевой за предоставленную возможность экспериментальной работы с энзимами в лаборатории Химии ферментов ТИБОХ ДВО РАН, а также всем сотрудникам этой лаборатории за ценные советы и помощь в работе.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Фитовирусы и устойчивость растений
1.1.1 Типы вирусных инфекций растений
1.1.2 Вирус мозаики сои
1.2 Метаболизм растений при патогенезе
1.2.1 Белки растений связанные с патогенезом (РЯ-белки)
1.2.2 Локализация и свойства РЛ-белков
* 1.2.3 Классификация РЛ-белков
1.2.4 Биологические свойства РЛ-белков
1.3 Пероксидаза
1.3.1 Характеристика фермента пероксидазы
1.3.2 Активность пероксидазы в связи с устойчивостью
1.3.3 Изоферменты пероксидазы
1.4 1->3-Р-0-Глюканазы растений
1.4.1 Свойства, специфичность и структура 1->3-|3-Э-глюканаз
# 1.4.2 Биологическая функция 1->3-р-0-глюканаз
1.5 Гликозидазы растений
1.6 Фенольные соединения при патогенезе растений
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Материалы
2.2 Методы работы с вирусами
2.2.1 Инфицирование растений вирусами
* 2.2.2 Выделение вируса мозаики сои
2.2.3 Электронная микроскопия
2.2.4 Выделение вируса табачной мозаики
2.2.5 Спектрофотометрическая характеристика вирусов
2.2.6 Электрофорез капсидных белков вируса мозаики сои
2.2.7 Минигель-электрофорез антигена вируса мозаики сои
2.2.8 Определение вирус-ингибирующей активности гомогенатов листьев сои
2.2.9 Определение инфекционности вируса мозаики сои
2.3 Энзиматические методы исследования
2.3.1 Приготовление растительных экстрактов
2.3.2 Определение активности пероксидазы
2.3.3 Изоэлектрофокусирование пероксидаз
2.3.4 Идентификация изоферментов пероксидазы
2.3.5 Определение изоэлектричесих точек изопероксидаз
2.3.6 Сканирование гелей
2.3.7 Определение активности 1-»3-Р-0-глюканазы
2.3.8 Жидкостная хроматография продуктов гидролиза ламина-рана 1->3-Р-Э-глюканазой сои
2.3.9 Определение влияния групп-специфических реагентов и природных эффекторов на 1->3-Р-0-глюканазу сои
2.3.10 Определение активности гликозидаз (р-О-глюкозидазы, Р-О-галактозидазы и а-О-маннозидазы)
2.3.11 Выделение и определение фенольных соединений
Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1 Характеристика вируса мозаики сои
3.2 Скрининг сортов сои на устойчивость к вирусу мозаики сои
и их биологическая характеристика
3.3 Изучение распределения инфекционности вируса мозаики
сои по сортам сои с различной устойчивостью
3.4 Распределение антигена вируса мозаики сои в сортах сои
с различной устойчивостью
3.5 Изучение вирус-ингибирующей активности экстрактов листьев
+32°С. Затем листья в камере освещали лампами дневного света (2100-2400люкс) непрерывно. Обычно через 48 ч после инфицирования подсчитывали число образовавшихся некрозов на каждой половинке листа. В процессе работы нами экспериментально было замечено, что на высушенных в гербарии листьях Top crop, некрозы становились более отчетливыми и выпуклыми, что уменьшает вероятность артефактов и облегчает их подсчет.
На инфекционность тестировали как первичные листья сои (которые заражали и обозначали 0-узел), так и тройчатые листья растений 1, 2, 3, 4 и 5 узлов (отсчет снизу). Части листьев (обычно центральной доли) собирали по мере их отрастания, через 1, 3, 7, 10, 14, 21, 28-ой день после инокулирования первичных.
В таблицах и на графике представлены усредненные по 5-6 листьям данные характерного опыта.
2.3 Энзиматические методы исследования
Активность карбогидраз, пероксидазы и множественность её молекулярных форм определяли в экстрактах, полученных из листьев каждого узла. Через 1, 7, 10, 14, 21 и 28 дней после инокулирования первичных листьев из массива растений изымали 5-6 растений, усредняя,таким образом, пробу. Листья каждого узла собирали отдельно. Из объединенных листьев соответствующего узла готовили навески (две биологические повторности, по 0,5-1,0 г) и хранили при -10°С до использования.
Во всех вариантах исследований каждая опытная и контрольная пробы были средними из 5-6 растений. На рисунках и в таблице представлены усредненные данные характерных опытов со стандартными квадратичными отклонениями [Kleczkowski, 1968, Цит. по Малиновский и др., 1993].
2.3.1 Приготовление растительных экстрактов
Для получения свободноэкстагируемой фракции ферментов листья механически гомогенизировали в 50 мМ сукцинатном буфере pH 5,2, в соотно-