Разработка молекулярно-кинетических маркеров стрессоустойчивости зерновых культур

• Автор: Бибишев, Владимир Александрович
• Шифр специальности: 06.01.05
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Краснодар
• Количество страниц: 151 с. : ил.

1. РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОМА ЭУКАРИОТ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
1.1 Клеточное ядро: - уровни регуляции экспрессии генома
1.1.1 Регуляция экспрессии генома на эпигенетическом уровне
1.1.2. Регуляция экспрессии генома на уровне транскрипции
1.1.3.Регуляция экспрессии генома на уровне процессинга пре-мРНК
1.1.4. Дифференцированный транспорт мРНК в цитоплазму
1.2 Цитоплазма: - уровни регуляции экспрессии генома
1.2.1.Поступление мРНК в цитоплазму
1.2.2. Цитоплазматические мРНП
1.2.3. Компартментализация мРНК в клетке
1.2.4. Регуляция экспрессии генома на уровне трансляции
1.2.5. Сигнальные системы клеток растений
1.3. Смена наборов синтезирующихся белков в ответ на воздействие экзо и эндогенных факторов
1.4. Методические подходы к изучению белоксинтезирующего аппарата эукариотических клеток и стабильности мРНК
1.5. Методы оценки стрессоустойчивости растений в селекционной
практике
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Подготовка растительного материала
2.2. Визуализация зоны интенсивного деления клеток проростков
2.3. Трансляция in vitro в бесклеточной системе из зародышей пшеницы
2.4. Трансляция in vitro в лизате из ретикулоцитов кролика
2.5. Выделение полирибосом
2.6. Введение in vivo радиоактивной метки в мРНК проростков
2.7. Воздействие экзогенных фитогормонов
2.8.Выделение суммарной РНК
2.9. Нуклеопротеид - целитная хроматография
2.10.Аффинная хроматография на поли(У)-сефарозе
2.11. Аффинно-адсорбционная хроматография на поли(У)-сефарозе
2.12.Электрофоретический анализ РНК
3. РАЗРАБОТКА МОЛЕКУЛЯРНО-КИНЕТИЧЕСКОГО МАРКЕРА ОЦЕНКИ СКОРОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ АДАПТИВНОГО ОТВЕТА СОРТОВ ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР ПРИ СТРЕССОВОМ ВОЗДЕЙСТВИИ
3.1. Эффект стрессиндуцироваииого изменения трансляционной
активности полирибосом (ТАП)
3.2. Эффект распада рибосомной РНК in vitro
4. РАЗРАБОТКА МОЛЕКУЛЯРНО-КИНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ОЦЕНКИ СТРЕССОУСТОЙЧИВОСТИ ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР НА ОСНОВЕ МЕХАНИЗМА, РЕГУЛИРУЮЩЕГО ИЗМЕНЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ И СТАБИЛЬНОСТИ мРНК
4.1. Эффект дифференциального распада поли(А) мРНК in vitro
4.2. Метод аффинно - адсорбционного (АА) фракционирования пула поли(А) мРНК растений
4.3. Принципы АА фракционирования полинуклеотидов
4.4. Функциональные особенности поли(А) мРНК фракций, получаемых в процессе АА хроматографии
4.5. "Скрытая" группа поли(А) мРНК
4..6. Модель механизма регуляции белкового синтеза у растений при стрессе
ВЫВОДЫ
РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ПРАКТИКИ
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Влияние неблагоприятных погодных условий в период вегетации растений является одной из главных причин снижения урожаев зерновых культур. Актуальная задача современной селекции - создание стрессоустойчивых и высокоурожайных сортов. Однако селекционная работа, ведущаяся на этом направлении, сопряжена с определенными сложностями, связанными с тем, что более устойчивые формы чаще всего обладают пониженной продуктивностью. Найдена обратная зависимость между степенью устойчивости организма и интенсивностью обмена веществ, что объясняется уходом растений в вынужденный покой (наиболее распространенный механизм, обеспечивающий неспецифическую устойчивость) [Удовенко и Гончарова, 1982 с. 144]. Кроме того, для Краснодарского края в зимний период характерны резкие колебания температуры, частые оттепели, вызывающие уменьшения глубины вынужденного покоя, и соответственно, снижение уровня неспецифической устойчивости озимых культур, а в весенний период не редки заморозки в первой половине и засуха во второй.
Для таких условий возделывания необходимы сорта, обладающие повышенной способностью к адаптации, т.е. приспособительными реакциями, связанными с оперативной регуляцией интенсивности физиологических процессов в ответ на изменение внешнего воздействия - так называемой "функциональной устойчивостью" [Ничипорович, 1988; Кумаков, 1995; Маймистов, 2001]. Причем, у сортов зерновых культур повышенная "функциональная устойчивость" может сочетаться с хорошей урожайностью, т.к. высокая интенсивность физиологических процессов является так же основой продуктивности [Ничипорович, 1988; Кумаков, 1995].
Селекционеры в своей работе по созданию стрессоустойчивых сортов вынуждены ориентироваться, как правило, только на конечный результат множества адаптивных реакций, используя в качестве критерия оценки генотипов - количество выживших при стрессе растений и степень повреждения клеток и тканей [Пучков, Набоков, 2001]. При этом вне их поля

репликации генома РНК-вирусов, при транскрипции мобильного элемента с участием собственного "смыслового" и внешнего "антисмыслового" промотора, а также при транскрипции ДНК-транспозонов с инвертированными повторами [Plasterk, 2002]. ДцРНК, гомологичная по нуклеотидной последовательности вирусам и мобильным элементам, инициирует подавление их экспрессии. Возникновение в эволюции генов микроРНК (miRNA) привело к появлению новой регуляторной системы, в которой ключевую роль играют некодирующие РЖ. Мишенью для miRNA служат жизненно важные гены, многие из которых кодируют факторы транскрипции, регулирующие апоптоз, скорость роста и клеточную дифференцировку [Bartel, 2004].
Явление РЖ-интерференции было открыто в ходе экспериментов по подавлению экспрессии генов при помощи антисмысловой РЖ у С. elegans. Предполагалось, что антисмысловая РЖ после комплементарного узнавания мРНК препятствует ее трансляции. Однако в некоторых экспериментах было обнаружено, что инъекции контрольной смысловой РЖ вызывают такой же эффект подавления экспрессии гена, как и инъекция антисмысловой РЖ [Fire et al., 1998]. Более тщательный анализ показал, что агентом, нарушающим экспрессию, является двухцепочечная РНК, содержащаяся в качестве примеси в обоих препаратах. Двухцепочечная РНК способна действовать в очень низких концентрациях. Для эффективного подавления экспрессии гена, количество двухцепочечной РЖ может быть меньше количества РЖ-мишени, что предполагает механизм действия отличный от возможного при антисмысловом подавлении простого стохиометрического взаимодействия между антисмысловой РЖ и мРЖ. Эффективность подавления экспрессии падает с уменьшением размера двухцепочечной РЖ. Для сильного подавления необходим дуплекс размером больше 100 пар нуклеотидов, а оптимальный размер - 500-1000 пар нуклеотидов [Hannon, 2002]. Позднее, в ходе биохимических исследований РЖ-интерференции, была продемонстрирована эффективность коротких (21-27 пары нуклеотидов) дуплексов, имеющих