Лазерный флуориметрический детектор со сверхвысокой чувствительностью для приборов капиллярного электрофореза

• Автор: Козулин, Роман Анатольевич
• Шифр специальности: 05.11.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 99 с. : ил.

Глава 1. МЕТОДЫ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ В СИСТЕМАХ КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА

1.1. Общая характеристика метода капиллярного электрофореза

1.2. Детектирование веществ в капиллярном электрофорезе

1.3. Оптические методы детектирования вещества в капилляре

1.3.1. Фотометрическое детектирование

1.3.2. Фототермическое детектирование

1.3.3. Лазерное флуоресцентное детектирование

1.3.4. Рефрактометрическое детектирование

1.3.5. Рамановское детектирование

1.4. Электрохимические методы детектирования

1.5. Прочие методы детектирования

1.6. Выводы
Глава 2. ОБОСНОВАНИЕ ТРЕБОВАНИЙ И РАЗРАБОТКА ЛИФ-ДЕТЕКТОРА ДЛЯ ПРИБОРА КЭ
2.1. Выбор спектрального диапазона работы ЛИФ детектора
2.2. Особенности оптических измерений в капилляре
2.3. Анализ отражённого излучения от капилляра
2.3.1. Суммарные отражения от стенок капилляра
2.3.2. Оценка интенсивности отражённого излучения в ограниченный телесный угол
2.4. Интенсивность флуоресценции от слабо концентрированной пробы
2.5. Конструктивные особенности ЛИФ-детектора для КЭ
2.5.1 Оптическая схема ЛИФ-детектора
2.5.2. Исследование чувствительности детектора
2.6. Влияние смещений лазерного луча на чувствительность измерений
2.7. Система автоматической компенсации отклонения возбуждающего 57 излучения от центра капилляра
Выводы

Глава 3. ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ИЗМЕРЕНИЯ В КАПИЛЛЯРЕ ПРИ ЛИФ-ДЕТЕКТИРОВАНИИ
3.1. Фоторазложеиие красителя при его движении через зону облучения
3.2. Кинетика флуоресценции и фотораспада красителя при возбуждении мощным излучением
3.3. Влияние интенсивности возбуждения и длительности облучения
пробы на чувствительность анализа
3.4. Экспериментальное исследование влияния фотораспада на чувствительность анализа
Выводы
Глава 4. РАЗРАБОТКА ЧЕТЫРЁХКАНАЛЬНОГО ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ДЕТЕКТОРА КЭ ДЛЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
4.1. Детектирование и распознавание фрагментов ДНК в капилляре
4.2. Выбор схемы построения многоканального флуоресцентного
детектора КЭ
4.3. Компенсация взаимного влияния перекрывающихся спектров флуоресценции на измерительные каналы детектора
4.4. Методика оптимизации флуоресцентного детектирования при определении последовательности ДНК в КЭ
Выводы
ВЫВОДЫ И ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ
ЛИТЕРАТУРА
ПРИЛОЖЕНИЕ 1. Описания и внешний вид приборов КЭ
ПРИЛОЖЕНИЕ 2. Внедрение приборов КЭ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ:
КЭ - капиллярный электрофорез
ЛИФ - лазерная индуцированная флуоресценция
ИФ - интерференционный фильтр
ЛФД - лавинный фотодиод
ФЭУ - фотоэлектронный умножитель
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ОаЬзу1 - 4-((4-(диметиламино)-фенил)азо)-бензолсульфоновая кислота
Оапзу1 - 6-(5-диметилфмипонафталин-1-сульфонил)амииопропанол
РАМ - 5(6)-карбоксифлуоресцеин
Ю10 - 5(6)-карбоксиродамин
Л60 - 5(6)-карбоксиродамин Ябв
ТАМ КА - 5(6)-карбокситетраметилродамин
ЯОХ - 5(6)-карбокси-Х-родамин
ПДМА - полидиметилакриламид

8 7 6 5
Рис. 2.4. Оптическая схема ЛИФ-детектора капиллярного электрофореза.
1 - полупроводниковый AlGaAs лазер, Х=763 нм; 2 - узкополосный светофильтр; 3 -капилляр; 4 - сферическое зеркало; 5 - Notch-фильтр; 6 - интерференционный светофильтр; 7 - фокусирующая линза; 8 - диафрагма; 9 - площадка фотодиода.
Исходя из расчетов в разрабатываемом детекторе требуется подавить около 8—9 порядков фонового сигнала. Такое подавление достигается использованием интерференционных светофильтров. Собранный зеркалом отражённый свет сначала блокируется голографическим светофильтром (Notch-фильтр). Notch-фильтр обладает высокой оптической плотностью для узкой линии лазера (D»5 е.о.п. для А.=765 нм) и пропускает вне полосы подавления до 85% излучения.
После Notch-фильтра устанавливается полосовой светофильтр, настроенный на максимум флуоресценции красителя с полушириной Д=25 нм, необходимый для устранения комбинационного рассеяния растворителей. Подавление света вне полосы пропускания >Зе.о.п.
Пройдя фильтры, ноток флуоресценции фокусируется на диафрагму диаметром 2 мм, необходимую для экранирования посторонних засветок. После диафрагмы свет попадает на фотоприёмник.
В качестве фотоприёмника выбран кремниевый ЛФД в модульной сборке фирмы «Hamamatsu» С5460-01, имеющий встроенную температурную компенсацию и низкошумящий усилитель.