Миграция лейкоцитов и способы ее регуляции при атеросклерозе

• Автор: Арефьева, Татьяна Игоревна
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 290 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение

Список сокращений

Обзор литературы

1. Атеросклероз - хроническое воспалительное заболевание артериальной 16 стенки с воспалительной и аутоиммунной составляющими .

1.1. Краткая история развития представлений о патогенезе 16 атеросклероза.

1.2. Характеристика воспалительного процесса в стенке артерии при 18 атеросклерозе.
1.3. Обострение воспаления как причина «дестабилизации» 22 атеросклеротической бляшки.
1.4. Системные проявления воспалительной реакции в сосудистой 24 стенке: повышение количества активированных лейкоцитов, увеличение концентрации «растворимых» маркеров воспаления.

1.5. Атеросклероз и системные воспалительные заболевания.

1.6. Опыт применения нестероидных противовоспалительных 27 препаратов при ИБС.

1.7. Регуляторные Т-лимфоциты при ИБС.
1.8. Рапамицин в кардиологии. Иммуномодулирующие свойства 31 рапамицина.
2. Воспаление как стадия ранозаживления.
2.1. Особенности воспалительной реакции при инфаркте миокарда.
3. Миграция лейкоцитов в очаг воспаления.
3.1. Этапы миграции лейкоцитов в сосудистую стенку. Молекулы 39 адгезии лейкоцитов. Интегрины как мишень для воздействий при ИБС.
3.2. Система активации плазминогена в адгезии и миграции 44 моноцитов.
3.3. Хемотаксические цитокины (хемокины)- стимуляторы миграции 48 лейкоцитов. Хемокины и атерогенез.
3.4. Рецепторы хемокинов, пути передачи внутриклеточных сигналов. 62 Рецептор МСР-1.
3.5. Рапамицин-чувствительный сигнальный каскад в миграции клеток.
4. Препараты, действующие на хемокины и рецепторы хемокинов, 72 противовоспалительный и антиатерогенный эффект.
4.1. МСР-1/ССЬ2 как основная мишень для разработки активаторов
и ингибиторов миграции моноцитов.
5. Заключение по обзору литературы.
Цель и задачи исследования
План исследования

Материалы и методы
Характеристика пациентов ИБС и доноров, включенных в анализ
экспозиции молекул адгезии и рецепторов урокиназы моноцитами, содержания урокиназы в периферической крови.
Характеристика пациентов ИБС, стабильной и нестабильной
стенокардией, включенных в анализ содержания МСР-1 и СРБ в плазме крови.
Характеристика пациентов со стабильной и нестабильной стенокардией и
доноров, включенных в исследование количества циркулирующих CD4+ активированных хелперных и регуляторных Т-лимфоцитов.
Характеристика пациентов, включенных в исследование зависимости
количества циркулирующих регуляторных Т-лимфоцитов от степени поражения коронарных артерий и в клинические испытания пептидного препарата Инграмон.
Получение образцов крови.
Получение и хранение образцов интимы коронарных сосудов.
Выделение клеток из образцов интимы артерий.
Выделение мононуклеарных лейкоцитов из периферической крови.
Выделение нейтрофильных гранулоцитов из периферической крови.
Получение обогащенной моноцитами суспензии клеток методом 96 центрифугирования в ступенчатом градиенте плотности.
Выделение моноцитов с помощью иммуномагнитных бус.
Выделение и культивирование СБ4+ лимфоцитов.
Культивирование линейных клеток ТНР-1 и .ГигкаП
Получение клонов клеток ТНР-1 со сниженным уровнем экспрессии 99 молекул СБ11Ь и СБ18.
Выделение и культивирование эндотелиальных клеток из пупочной вены 99 человека.
Оценка адгезии клеток.
Изучение миграции клеток в модифицированной камере Бойдена и в системе 101 ТгапэзуеП.
Определение уровня фосфорилирования киназ в клетках с помощью 103 Вестерн-блоттинга.
Активация лейкоцитов в «цельной» крови.
Иммунофенотипирование клеток (выявление поверхностных и 104 внутриклеточных антигенов) методом цитофлуориметрии в потоке.
Оценка параметров связывания урокиназы с моноцитами.
Определение концентрации урокиназы, МСР-1 и белков острой фазы 107 воспаления (СРБ, фибриногена) в крови.
Морфологический и иммуногистохимический анализ образцов интимы 108 коронарных артерий и аорт человека.
Выделение мРНК из образцов интимы коронарных артерий человека.

Реакция обратной транскрипции и полимеразно-цепная реакция (ПЦР). Расчет и синтез пептидных фрагментов хемокина МСР-1.
Оценка способность пептидов к образованию димеров.
Оценка проникновения пептида X в очаг воспаления.
Оценка устойчивости пептидов в плазме крови ex vivo.
Тестирование пептидов по их действию на миграцию клеток in vitro, экспозицию моноцитами молекул адгезии и содержание внутриклеточного Са++.
Изучение хемотаксиса клеток in vivo в модели «air pouch» («воздушный мешок») у мышей.
Модель подкожного воспаления у крыс и приматов.
Баллонная ангиопластика левой общей сонной артерии крыс.
Оценка воспалительной реакции при подкожной имплантации агарозного геля.
Модель ранозаживления у мышей.
Модель ишемии нижней конечности у крыс.
Модель инфаркта миокарда у крыс.
Анализ влияния пептида X на димеризацию МСР-1 в растворе с помощью гель-электрофореза и Вестерн-блоттинга.
Анализ взаимодействия МСР-1 с гепарином с помощью безмаркерного биосенсорного прибора «Пикоскоп®» и ИФА.
Статистический анализ.
Результаты
1. Воспаление в патогенезе атеросклероза.
1.1. Анализ клеточного состава и экспрессии цитокинов в образцах атеросклеротических бляшек коронарных артерий человека.
1.2. Концентрация МСР-1 и СРБ в плазме крови пациентов с ИБС при нестабильной стенокардии и стабильной стенокардии напряжения.
1.3. Экспрессия молекул адгезии и рецепторов урокиназы моноцитами крови при ИБС. Содержание урокиназы на моноцитах и в крови пациентов.
1.4. Содержание активированных хелперных и регуляторных Т-клеток в крови пациентов с ИБС, стабильной и нестабильной стенокардией.
1.5. Содержание регуляторных Т-клеток у пациентов с ИБС, стабильной стенокардией, с различной выраженностью атеросклеротического поражения коронарных артерий.
2. Особенности адгезии и миграции моноцитов.
2.1. Адгезия и миграция моноцитарных клеток на фибриногене и продуктах его деградации.
2.2. Участие (32-интегринов CDllb/CD18 и CDllc/CD18 в адгезии и

Несмотря на то, что нейтрофильные гранулоциты не имеют первостепенного значения для ранозаживления в целом (Simpson, Ross, 1972), дисфункция нейтрофильного звена может явиться причиной инфицирования ран и развития других осложнений (Canturk et al., 2001).
Моноциты мигрируют в область раны на 2-4 сутки, и до начала пролиферации фибробластов они являются основной клеточной популяцией в этой зоне. Моноциты/макрофаги необходимы для восстановления целостности тканей. Благодаря способности фагоцитировать дебрис, вырабатывать активные соединения кислорода и протеолитические ферменты (коллагеназу, эластазу) эти клетки обладают противомикробной активностью и принимают участие в очищении раны от продуктов распада ткани {Witte, Barbul, 1997). Однако основной вклад моноцитов/макрофагов в процесс ранозаживления заключается в продукции широкого спектра цитокинов и факторов роста. Данные медиаторы паракринно воздействуют на другие клетки, в том числе моноциты и лимфоциты, вызывают хемотаксис и пролиферацию фибробластов, эндотелиальных клеток, синтез белков внеклеточного матрикса ( Wahl, 1985; Barbul, 1990). Основные цитокины моноцитов/макрофагов и их биологическая активность суммированы в таблице 2.
Таблица 2. Эффекты цитокинов, продуцируемых моноцитами.
Цитокин Пролиферация ЭК Ангиоге- нез Пролиферация фибробластов Синтез коллагена
ФНОа +/- + +/- +/-
ИЛ-1 +/- +/- +/-
ИЛ-6 + +
ТФРр -/+ + -/+ +
ТФРа -/+ + -/+ -/+
PDGF + + + +
IGF-1 + + + +
bFGF + +
EGF + +
VEGF + +
/5DGF - фактор роста из тромбоцитов, /GF-7 — инсулиноподобный фактор роста-1, ЬЕЄЕ — фактор роста фибробластов основной, ЕСЕ-эпидермальный фактор роста, УЕЄЕ — фактор роста сосудистого эндотелия.