Цитоскелет как система путей внутриклеточного транспорта в клетках животных

• Автор: Бураков, Антон Владимирович
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 232 с. : ил.

1. ОГЛАВЛЕНИЕ
1. Оглавление
2. Введение
История вопроса, актуальность работы

Задачи
Научная новизна и практическая ценность работы
Степень достоверности и апробация результатов
Положения, выносимые на защиту
3. Обзор литературы
Тубулиновая транспортная система
Микротрубочки - общие сведения
Динамические свойства микротрубочек
Центросома. Процессы организации микротрубочек: нуклеация и заякоривание
Позиционирование центросомы в клетке
Связь центросомы с клеточным ядром
Плюс-концевой транспорт по микротрубочкам: кинезины
Минус-концевой транспорт по микротрубочкам: динеин
Строение молекулы динеина и динактинового комплекса
Регуляция активности динеина и динактина
Транспортные функции динеина
Роль динеина в процессах организации микротрубочек
Двунаправленность транспорта по тубулиновой транспортной сети
Актиновая транспортная система. Миозины
4. Материалы и методы исследования
Клеточные культуры
Способы фиксации клеток
Метод непрямой иммунофлуоресценции
Методы прямой флуоресценции
Антитела и красители
Вещества и специфические ингибиторы
Получение цитопластов
Трансфекция клеток млекопитающих плазмидной ДНК
Деполимеризация и реполимеризация микротрубочек
Локальная разборка микротрубочек
Сборка микротрубочек на центросомах in vitro
Изучение движения меланосом в системе in vitro
Создание ДНК-конструкций
Выделение плазмидной ДНК
Выделение тубулина для экспериментов по сборке микротрубочек
в системе in vitro
Выделение рекомбинантных белков
Белковый электрофорез и иммуноблотинг
Проверка киназной активности
Приборы для световой микроскопии
Электронная микроскопия
Анализ изображений и видео
5. Результаты и обсуждение
Часть 1. Изучение механизмов позиционирования центросом
в интерфазных клетках млекопитающих
§ 1. Прижизненное наблюдение микротрубочек
§ 2. Экспериментальная модель локального разрушения микротрубочек
§ 3. Перемещение центросомы в клетках и цитопластах
при локальном разрушении микротрубочек
§ 4. Роль актомиозиновой сократимости в перемещении центросомы
§ 5. Роль динеина в перемещении центросомы
§ 6. Работа динеина по перемещению центросомы регулируется ГТФазой Cdc42
§ 7. Участие динамики плюс-концов микротрубочек
в процессе позиционирования центросомы
§ 8. Цитопласты как модель для изучения центрирующих сил динеина
§ 9. Микротрубочки утрачивают радиальность по мере старения цитопластов
§ 10. Хаотизация микротрубочек в стареющих цитопластах
не связана с дисфункцией центросом
§ 11. Хаотизация микротрубочек в стареющих цитопластах не связана
со стабилизацией микротрубочек
§ 12. В стареющих цитопластах меняется поведение микротрубочек
на краю клетки
§ 13. Кортекс стареющих цитопластов содержит меньше динактина
§ 14. Положение центросом в цитопластах не зависит от взаимодействия

микротрубочек с кортексом
§ 15. Предпосылки для построения модели центрирования
§ 16. Качественный анализ данных: дестабилизирующее влияние
плюс-концов микротрубочек
§ 17. Баланс сил на центросоме обладает центрирующим эффектом в случае,
когда тянущая сила динеина достаточно велика
§ 18. При пространственных изменениях системы микротрубочек
центросома претерпевает сдвиг из центральной области
§ 19. Оценка приложенных к центросоме сил и её мобильности
в предложенной модели центрирования
§ 20. Механизмы центрирования в клетках разной формы и размера
§ 21. Способен ли связанный с микротрубочками кинезин генерировать
децентрирующую силу?
§ 22. Резюме
Часть 2. Изучение роли протеинкиназы LOSK и динеина в формировании
радиальной системы микротрубочек
§ 1. Изучение ферментативной активности киназы LOSK in vitro
§ 2. Полноразмерная LOSK частично солокализуется с микротрубочками, а N-концевой
фрагмент LOSK диффузно распределён по цитоплазме
§ 3. Оверэкспрессия доминантно-негативного каталитического домена LOSK приводит
к нарушению радиальности микротрубочек в клетках линии Vero
§ 4. Деплеция LOSK посредством РНК-интерференции также нарушает радиальность
микротрубочек
§ 5. Доминантно-негативный каталитический домен LOSK нарушает радиальность
микротрубочек в различных типах клеток
§ 6. Подавление активности LOSK не влияет на целостность центросомы и нуклеацию
на ней микротрубочек, но нарушает процесс заякоривания
§ 7. Ингибирование LOSK нарушает поляризацию аппарата Гольджи на краю
экспериментальной раны монослоя
§ 8. Изменение способности клеток к локомоции может служить индикатором
нарушений внутриклеточного транспорта
§ 9. Ингибирование LOSK замедляет движение клеток и снижает его направленность,
а также стабилизирует фокальные контакты
§ 10. Выбор экспериментальной системы для изучения роли динеина,
находящегося на центросоме

активность в отношении тубулина, и в структурных белках CLIP-170 и CLIP-115, где он является сайтом взаимодействия с тубулином (Li et al., 2002). CAP-Gly домен в pl50Glued in vitro может взаимодействовать с тубулином, но in vivo pl50Glued связывается с микротрубочками преимущественно через CLIP-170, ассоциируясь с С-концевой частью последнего (Coquelle et al., 2002; Lansbergen et al., 2004; Akhmanova, Hoogenraad, 2005). CAP-Gly домен pl50Glued, кроме того, связывается с белком ЕВ-1 (Akhmanova, Hoogenraad, 2005). И CLIP-170, и ЕВ-1 имеют большее сродство к ГТФ-тубулину, находящемуся на конце растущей микротрубочки, чем к ГДФ-тубулину, образующемуся в микротрубочке через некоторое время после ее полимеризации. Поэтому в клетках динактин концентрируется на плюс-концах растущих микротрубочек.
Рисунок 2. Строение молекул цитоплазматического динеина и динактина.
А - взаимодействие молекул динеина и динактина с микротрубочкой и с транспортируемой везикулой. 1 - микротрубочка, показаны димеры тубулина;
2 — выступ моторного домена динеина, связывающийся с микротрубочкой;
3 - моторный домен динеина (разной насыщенностью тона показаны различные ААА-домены); 4 - промежуточные цепи динеина; 5 - легкие цепи динеина; б - «рука» динактина, белок р150С1иес1; 7 - «плечо» динактина, включающее фітамент из белка Агр1; 8 -спектрин; 9 - трансмембранный белок; 10 - полость везикулы.