Репрограммирование клеток дермальной папиллы волосяного фолликула человека до плюрипотентного состояния

• Автор: Мучкаева, Ирина Алексеевна
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 118 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Молекулярные механизмы индуцированной плюрипотентности

L1Л. Ауторегуляторная петля. Баланс между Klf4 и с-Мус. Влияние локуса Ink4/Arf

1.1.2. Эпигенетическая регуляция экспрессии генов в плюрипотентных стволовых клетках

1.1.3. Роль микроРНК в поддержании плюрипотентности

1.1.4. Влияние старения и иммортализации клеток на репрограммирование

1.1.5. Сложность, ступенчатость и стохастичность процесса индукции плюрипотентности
1.2. Методы репрограммирования соматических клеток
1.2.1. Новые способы репрограммированирования соматических клеток до плюрипотентного состояния
1.2.2. Использование малых молекул при репрограммировании
1.2.3. Прямое репрограммирование соматических клеток
1.3. Различия между иПСК и ЭСК. Эпигенетическая «память» иПСК
1.4. Перспективы использования иПСК в терапии
1.4.1. Подходы к клиническому применению иПСК
1.5. Общая характеристика клеток дермальной папиллы
II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
II. 1. МАТЕРИАЛЫ
II. 1.1. Химические реактивы
II. 1.2. Клеточные культуры
II.2. МЕТОДЫ
11.2. 1. Выделение и культивирование эмбриональных фибробластов мыши
11.2. 2. Приготовление фидерного слоя МЭФ
11.2.3. Выделение и культивирование клеток дермальной папиллы человека
11.2.4. Культивирование фибробластов человека
11.2.5. Культивирование плюрипотентных стволовых клеток человека
11.2.6. Репрограммирование клеток ДП и 1608ЬТ
II.2.5. Отбор Тга-1-60+ клонов
И.2.7. Тест на активность теломеразы в клетках
II.2.8. Иммуноцитохимическое исследование
11.2.9. Проточная цитофлуориметрия
11.2.10. Выявление активности щелочной фосфатазы
11.2.11. Получение и культивирование эмбриоидных телец
И.2.12. Приготовление срезов эмбриоидных телец и их окрашивание
II.2.13. Направленная дифференцировка иПСК in vitro
И.2.14. Выделение тотальной РНК из клеток
11.2.15. Синтез кДНК и ОТ - ПЦР (обратная транскрипция совмещенная с
полимеразной цепной реакцией)
П.2.15.1. Полимеразная цепная реакция
11.2.16. ПЦР в реальном времени
11.2.17. Кариотипировние
11.2.18. Тест на тератомообразование
11.2.19. Иммуногистохимия
III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
III. 1. Инфицирование клеток ДП человека
111.2. Выделение и культивирование иПСК
111.3. Подтверждение плюрипотентного статуса полученных иПСК
111.3.1. Иммуноцитохимический анализ
111.3.2. Проточная цитофлуориметрия
111.3.3. Пролиферативная активность иПСК
111.3.4. Цитогенетический анализ
111.3.5. Определение теломеразной активности
111.3.5. ОТ-ПЦР анализ
Ш.ЗЛ. ПЦР в реальном времени
III.4 Исследование дифференцировочного потенциала иПСК - ДП и иПСК -1608ЙТ
111.4.1. Дифференцировка полученных иПСК in vitro. Образование эмбриоидных телец
111.4.2. Дифференцировка иПСК in vitro в остеогенном направлении
111.4.3. Дифференцировка иПСК in vitro в гепатоцитарном направлении
111.4.4. Дифференцировка иПСК in vitro в нейральном направлении
111.4.5. Дифференцировка иПСК in vivo
III.5. Эффективность репрограммирования полученных иПСК
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ЭСК - эмбриональные стволовые клетки
иПСК - индуцированные плюрипотентные стволовые клетки
ГТСК - плюрипотентные стволовые клетки
дп - дермальная папилла
МЭФ - эмбриональные фибробласты мыши
НСК - нейральные стволовые клетки
1608hT- линия фибробластов кожи человека, теломеризованных геном hTERT ЭТ - эмбриоидные тельца
иПСК - ДП - иПСК, полученные в результате репрограммирования клеток ДП иПСК - 1608hT - иПСК, полученные в результате репрограммирования 1608hT VPA - вальпроевая кислота, 2-пропилвалериановая кислота KMOS - набор транскрипционных факторов Klf4, с-Мус, Oct4, Sox2 миРНК, miR - микроРНК
siRNA - малые интерферирующие PHK(small interfering RNA)
FBS - фетальная бычья сыворотка (fetal bovine serum)
DAPI - 4,6-диамидино-2-фенилиндол (4,6-diamidino-2-phenylindole)
7-AAD - 7-миноактиномицин Д (7-Aminoactinomycin D)
АФП - альфафетопротеин CK - цитокератин
FGF -фактор роста фибробластов (fibroblast growth factor)
HGF - фактор роста гепатоцитов (hepatocyte growth factor)
EGF - эпидермальный фактор роста (epidermal growth factor)
BMP - костный морфогенетический белок (bone morphogenetic protein)

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
11.1. МАТЕРИАЛЫ
П.1.1. Химические реактивы
В работе использовались реактивы, производимые фирмами Евроген, Силекс, ПанЭко, BD Biosciences, Chemicon, Novocastra, Vector Laboratories, Roche, Sigma, Fermentas, Zimo Research, Invitrogen, PAA, Peprotech, Hyclone, Gibco, STEMCELL Technologies, R&D Systems.
II. 1.2. Клеточные культуры
В работе были использованы следующие культуры клеток: линия
фибробластов кожи взрослого человека, иммортализовнная с помощью лентивирусной конструкции, содержащей ген каталитического компонента теломеразы человека hTERT (pLA-CMV-hTERT) - 1608hT была любезно
предоставлены д.б.н. Е.Е. Егоровым; клетки ДП волосяного фолликула человека; ЭСК человека линии hESM05, любезно предоставленные д.б.н. C.JL Киселевым; первичная культура МЭФ.