Депо-управляемый вход кальция в клеточной модели болезни Хантингтона

• Автор: Вигонт, Владимир Александрович
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 82 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Список используемых сокращений

Введение

Цели и задачи исследования

Основные положения, выносимые на защиту

1 Обзор литературы

1.1 Ионы кальция как внутриклеточный посредник

1.2 Внутриклеточные кальциевые депо

1.2.1. Поддержание низкой концентрации кальция в цитозоле

1.2.2. Выброс кальция из депо

1.2.3. Сенсоры кальция в ЭР: белки STIM1 и STIM2

1.3.4. Каналы утечки в ЭР
1.3 Кальциевые каналы плазматической мембраны
1.3.1. Потенциап-управляемые кальциевые каналы
1.3.2. Лиганд-управляемые каналы. Рецептор NMDA
1.4 Депо-управляемый вход кальция
1.4.1. CRAC каналы
1.4.2. Каналы, образованные белками семейства TRP
1.5 Путь активации транскрипционного фактора NF-kB
1.6 Болезнь Хантингтона
1.6.1. Белок хантингппш
1.6.2. Белковые агрегаты
1.6.3. Кальциевая гипотеза болезни Хантингтона
2 Материалы и методы
2.1 Клетки
2.2 Соединения EVP
2.3 Трансфекция и РНК интерференция
2.4 Электрофорез и иммуноблоттинг
2.5 Получение первичной культуры нейронов стриатума
2.6 Получение лентивируса и инфицирование нейронов
2.7 Электрофизиологические измерения
2.8 Растворы

3 Результаты и обсуждение
стр38
3 1 В клетках нейробластомы человека ЭК-БТ-БН, моделирующих болезнь Хантингтона, наблюдается аномально-большой депо-зависимый вход кальция стр38
3 2В клетках первичной культуры нейронов стриатума мыши, моделирующих болезнь Хантингтона, наблюдается аномально-большой депо-зависимый вход кальция стр42
3 3 Соединение ЕУР4593 способно блокировать аномальный депо-управляемый вход кальция в клетках 8К-14-8Н НШ38С) и М8Ы Нй138<3-1ехоп стр46
3 4 Белок ТЯРС! входит в состав каналов, отвечающих за поддержание депо-управляемого входа кальция в клетках 8К-Ы-БI I Ни 138() стр53
3 5 ЕУР4593 не оказывает влияние на депо-зависимый вход кальция в клетках 8К-Г4-8Н с оверэкспрессией белка ТКРС1 стр58
3 6 Для активации депо-управляемого входа кальция в клетках Ни138С> требуется присутствие белка БИМ! стрбО
Заключение
Выводы
Список публикаций по теме диссертации
Список цитируемой литературы

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВАРТА 1,2-Бис(2-АмнноФенокси)этанТетрауксусная кислота CRAC кальциевый (канал), активируемый высвобождением кальция (Calcium Release-Activated Calcium (channel))
DAG ДиАцилГлицерол
EDTA ЭтиленДиаминТетрауксусная кислота
EGTA ЭтиленГликольТетрауксусная кислота
EVP4593 6-амино-4-(4-феноксифенетиламино)хиназолин
EVP 14808 6-амино-4-(2-(3-пиридил)этиламино)хиназолин
FURA-2 флуоресцентный кальциевый зонд
Htt хантингтин (белок)
1Рз инозитол(1,4,5)трисфосфат
IP3R рецептор инозитол(1,4,5)трисфосфата
MSN срединные шипиковые нейроны (Medium Spiny Neurons)
NF-кВ ядерный фактор кВ (Nuclear Factor кВ)
NMDA N-Метил D-Аспартат
NMDAR Рецептор N-Метил D-Аспартата (Ионотропный рецептор глутамата)
NMDG N-Метил D Глюкамин PIP2 ФосфатидИлинозитолбисФосфат PLC ФосфоЛипаза С RyR Рецептор Рианодина
SERCA кальциевая ATP-за эндоплазматического ретикулума SK-N-SH клетки нейробластомы человека
SOC Депо-управляемый (вход) катионов (Store-Operated Cation (entry))
STIM Stromal Interaction Molecule
TRP Transient Receptor Potential (семейство белков)
TRPC Transient Receptor Potential Canonical (подсемейство белков)
VGCC потенциал-управляемые кальциевые каналы (Voltage-Gated Calcium Channels) БХ Болезнь Хантингтона ПМ Плазматическая Мембрана ЭР Эндоплазматический Ретикулум

добавляли 1,5 мл раствора трипсина (0.1%-ного трипсина, 0.1%-иой ДНКазы I в растворе для препарирования), в котором происходила инкубация в течении 6-7 минут при температуре 37°С. Трипсин инактивировали 10 мл среды для культивирования нейронов (Neurobasal-A, 3%-ная FBS, 3%-ный В27, 0.6 мг/мл L-Gln) и клетки осаждали центрифугированием при 4°С на 2000 G в течении 4 минут. После удаления супернатанта к осадку добаляли 500-750 мкл раствора ДНКазы I (0.5%-ной ДНКазы I в растворе для препарирования) и клетки прогонялись через носик пипетки, упертый в дно пробирки, до исчезновения фрагментов ткани. К раствору ДНКазы I с клетками добавляли 10 мл раствора для препарирования и, затем клетки осаждали центрифугированием при 4°С на 2000 G в течении 4 минут. Супернтатант заменяли на 10 мл среды для культивирования и повторяли центрифугирование. После центрифугирования среду заменяли на новую, осадок из клеток пипетировался, и далее клетки рассеивали по чашкам Петри с покровными стелами, обработанными 0.01%-ным поли-Ь-лпзином.
2.6 Получение лентнвпруса и инфицирование нейіронов
Шаттл-векторы, кодирующие N-концевые фрагменты белков Httl5Q-lexon (147 аминокислот) н Httl38Q-lexon (270 аминокислот), конъюгированные с HA-tag, H1V-1 вектор
8.9 и VSVG плазмиды покровных гликопротеинов для создания лентивирусов были предоставлены профессором И. Б. Безпрозванным (UT Southwestern medical center, США). Вирусы Lenti-Httl5Q-lexon и Lenti-Httl38Q-lexon созданы посредством котрансфекции шаттл-векторов с HIV-1 вектором 8.9 (А8.9) и VSVG плазмид покровных гликопротеинов в пакующую клеточную линию НЕК293Т. К 1 мл среды без сыворотки добавлялось 7.5 мкг шаттл-плазмиды, 6 мкг А8.9, 2 мкг VSVG плазмид и 60 мкл трасфецирующего агента PEI (Polysciences Inc, США) п инкубировалось в течении 20 мин при комнатной температуре. Полученный 1 мл раствора использовался на чашку Петри 010 см, с свежей средой (для культивирования тех клеток, для инфицирования которых затем будет использован вирус) и 50-70% монослоем клеток ЫЕК293Т. После добавления раствора для трансфекции в среду, чашки Петри с клетками инкубировали в термостате в течение 24 часов при температуре 37°С, а затем 72 часа при температуре 32°С. За это время упакованные вирусы выделялись клетками в среду. По истечению срока инкубации среда с вирусами была отфильтрована (0 0.45 мкм) и немедленно заморожена в жидком азоте. Хранение производилось при -80°С.
Для определения титра вируса использовали метод иммуноокрашпвания с антителами к HA-tag. Монослой клеток НЕК293Т в 24 луночном планшете на покровных стеклах инфицировали с помощью добавления среды с вирусом к среде культивирования в разных