Фетальные клетки в материнском кровообращении : выделение фетальных клеток и FISH анализ

• Автор: Бабочкина, Татьяна Ивановна
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Базель
• Количество страниц: 131 с. : ил.

Оглавление
Оглавление
Резюме
Цели
1. Введение

1.1. Инвазивный метод исследования крови, недостатки его использования

1.2. Альтернативная неинвазивная диагностика

1.2.1. История открытия фетальных клеток и внеклеточной ДНК в материнском кровообращение

1.2.2. Разнообразие клеток плода в материнском кровообращение

1.3. Неинвазивная пренатальная диагностика на эмбриональных эритробластах, выделенных из крови беременных женщин: текущее положение дел
1.З.1.. Количество клеток плода в материнском кровообращение при нормальных и анеуплоидных беременностях
1.3.2. Выделение эмбриональных эритробластов из материнской крови
1.3.2.1. Метод градиентного центрифугирования
1.3.2.2. Поверхностные антигены эритробластов
1.3.2.3. Устройства для сортинга меченных антителами клеток
1.3.2.4. Обогащение НоэеКеВер
1.3.2.5. Галактозо-специфичное обогащение посредством агглютинина из сои, галактозо-специфичного лектина
1.3.3. Анализ и идентификация обогащенных клеток
1.3.3.1. Идентификация эмбрионального происхождения изолированных из материнской крови эритробластов

1.3.3.1.1. Морфологические критерии
1.3.3.1.2. Мечение фетального гемоглобина
1.3.3.2. Анализ эмбриональных эритробластов,
обогащенных из крови беременных женщин
1.3.3.2.1. Цепная полимеразная реакция (ПЦР)
1.3.3.2.2. Флюоресцентная in situ гибридизация (FISH)
1.3.4. Клинические испытания неинвазивной диагностики
1.3.5. Ограничения клинического применения неинвазивной диагностики
1.3.6. Роль и место эмбриональных клеток в неинвазивной пренатальной диагностике
2. Результаты
2.1. Оптимизация FISH на образцах крови пуповины
2.1.1. Предобработка. Пепсин, протеиназа К и HCL
2.1.2. Предобработка препаратов при помощи микроволнового излучения
2.1.3. Выбор проб для FISH анализа эритробластов
2.1.4. Мечение Y хромосомы двумя различными пробами в одношаговой XYY-FISH гибридизации, в которой Y-хромосома была помечена двумя различными пробами (a- and Ill-satellite) того же самого цвета
2.1.5. Разработка методов иммуноцитохимии (ICC) на гликофорин (GPA) окрашенных клетках (идентификация клеток плода) и последующей FISH гибридизации (генетическая диагностика) на препаратах крови пуповины
2.1.6. Выводы по оптимизации FISH гибридизации на образцах пуповинной крови
2.2. FISH анализ на образцах из материнской крови
2.2.1. XYVysis FISH
2.2.2. XYY Qbiogene FISH

2.2.3. XY Vysis FISH на препаратах, обработанных микроволновым излучением
2.2.4. XYY Qbiogene FISH на препаратах, обработанных микроволновым излучением
2.2.5. Анализ структуры популяции эритробластов при беременностях с плодом мужского пола по отдельности с обнаруженным Y сигналом и без Y сигнала
2.2.6. XYY Qbiogene FISH на препаратах обработанных пепсином
2.2.7. Анализ FISH с Qbiogene Хс- и 18с- хромосомными пробами
2.2.8. Заключение: FISH на образцах материнской крови
2.3. Сравнительный анализ эритробластов, культивированных при различных концентрациях кислорода
2.4. FISH гибридизация после инкубации при 3%- и 20%-ой концентрациях кислорода
2.5. Измерения эритробластов
2.6. TUNEL (Deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End Labeling) анализ эритробластов
2.6.1. TUNEL и FISH анализ ядер эритробластов из крови пуповины
2.6.2. TUNEL анализ ядер эритробластов в материнской
крови
2.7. Детекция клеток плода в цельной крови
2.8. Оценка возможностей галактозо-специфического обогащения посредством агглютинина из сои, галактозо-специфичного лектина, для изоляции эритробластов из материнской крови
2.9. Спектральный морфометрический сравнительный анализ эритробластов из материнской и пуповинной крови
2.10. Единичных клеток ПЦР анализ эритробластов (Taqman), изолированных, при помощи Laser Microdissection and Pressure Catapulting (LMPC) технологии
2.10.1. ПС.Р анализ в реальном времени эритробластов полученных путем микродиссекции из крови пуповины

Рисунок 3. XY Vysis FISH на ICC (СРЛ)-окрашенных эритробластов из крови пуповины.
Случай Время гибридизации, часы Проба Эффективно сть, %
1 9 Vysis XY
2 5 Vysis XY
3 5 Vysis XY
4 5 Vysis XY
5 5 Vysis XY

В среднем
Таблица 3. XY Vysis FISH с предварительной обработкой стекол в микроволновой печи на ICC (GPA)-окрашенных эритробластах из крови пуповины.
2.1.6. Выводы по оптимизации FISH гибридизации на образцах пуповинной крови
Чтобы оптимизировать FISH протокол для гибридизации эритробластов мы проверили различные предобработки препаратов: пепсин, MCI. протеиназа К и микроволновая активация. Лучшие результаты продемонстрировали микроволновая активация. Эта предобработка позволяет достичь хорошей эффективности FISH с сохранением хорошей морфологии клеток. Все другие примененные виды предобработок привели к разрушению морфологии клеток, что является существенным недостатком.