Участие белков семейства Homer в регуляции депо-управляемого входа кальция в клетки А-431

• Автор: Шалыгин, Алексей Вадимович
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 106 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
Список сокращений
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Депо-управляемый вход кальция
1.1.1. Молекулярный состав депо-управляемых каналов
1.1.2. Депо-управляемые каналы в клетках А
1.2. Белки семейства Stim
1.2.1. Структура и функции доменов белков Stirn
1.2.2. Роль белков Stim в кальциевой сигнализации клеток
1.3. Адаптерные белки семейства Homer
1.3.1. Изоформы.белков Homer и регуляция их концентрации
1.3.2. Структура.белков Homer
1.3.3. Белки Homer определяют морфологию дендритных шипиков
1.3.4. Взаимодействие белков Homer с белками кальциевой сигнализации
1.3.5. Регуляция локализации mGluR белками Homer
1.3.6. Участие белков Homer в сигнальных каскадах
1.3.7. Homer участвует в регуляции направления конуса роста аксона..
1.3.8. Взаимодейстиве белков Homer с белками RyR
1.3.9. Регуляция каналов TRPC белками Homer
2. ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Материалы и клетки
3.2. Метод локальной фиксации потенциала (patch clamp)
3.3. Электрофорез и иммуноблоттинг (ИБ)
3.4. Экспрессия и очистка рекомбинантных белков GST-Homer 1с и GST-Homer la
3.5. Получение микросом, обогащенных 1P3R первого типа (IP3R1)
3.6. Клеточный лизат и эксперименты pull-down (PD)
4. РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1. В клетках А431 экспрессируются длинные изоформы белков семейства
Homer
4.2; Разобщение белков Homer с белками-мишенями, вызванное пептидом PPKKFR, активирует вход кальция в клетках А

4.3. К отделению белков Homer от белков-мишеней, вызванному пептидом PPKKFR, чувствительны каналы 1„иП, но не каналы Imax
4.4. Каналы Imin активируются изоформой Homer 1а, но не Homer 1с
4.5.1Р3 нарушает взаимодействие белков Homer с IP3R
4.6. Воздействие 1Р3 и разобщение взаимодействия нативных белков Homer с белками-мишенями влияют на работу каналов 1„цП неаддитивно
4.7. Скорость развития активности каналов Imjn, вызванной белком Homer 1а или пептидом PPKKFR, в клетках А
5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
6. ВЫВОДЫ
Благодарности
Список публикаций по теме диссертации
Список цитированной литературы
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ПМ -плазматическая мембрана
ЭР - эндоплазматический ретикулум
АМРА-рецептор - рецептор, связывающий альфа-
аминометилизоксазолпропионовую кислоту
ВАРТА-АМ- 1,2-бис(2-аминофенокси)этантетрауксусная кислота
BDNF - brain-derived neurotrophic factor
ВК - калыцш-зависимые большие калиевые каналов
CaMKII - кальмодулин-зависимая протеин-киназа
CaN - кальцийнейрин
СС - coil-coiled
CRAC - Са2+ release activating channel DHPG - (S)-3,5-dihydroxyphenylglycine
ERK - extracellular signal-regulated kinase (киназа, регулируемая внеклеточным сигналом)
EVH1 - enabled/vasodilator-stimulated phosphoprotein (Ena/VASP) homology 1 GAP - GTPhase-activating protein (белки, активирующие ГТФазу)
IP3 —инозитол 1,4,5-трисфосфата
IP3R - рецептор инозитол 1,4,5-трисфосфата
IP3RI - рецептор инозитол 1,4,5-трисфосфата первого типа
IP3R3 - рецептор инозитол 1,4,5-трисфосфата третьего типа
LTP - long-term potentiation (долговременной потенциация)
mEPSC — миниатюрные постсинаптическне возбуждающие токи
mGluR - метаботропный глутаматный рецептор
NFAT - nuclear factor of activated T-cells (ядерный фактор активированных Т-клеток)
NMDA-рецептор - ионотроиный рецептор, связывающий М-метил-Б-аспартат
РАСАР - pituitary adenylate cyclase activating polypeptides
PIP2 - фосфатидилинозитол 4,5-бисфосфат
РІРз - фосфатидилинозитол-3,4,5-трисфосфат
РМСА — кальциевая АТФаза плазматической мембраны
PSD - постсинаптическая плотность
RyR — рианодиновый рецептор
Белки Horner lbc или 3 связывают в единый комплекс рецептор плазматической мембраны mGluR и канал эндоплазматического ретикулума IP3R. Этот вывод сделан на основании колокализации белков и того, что IP3R коимуннопреципетировал и Homer, и mGluR, однако не продемонстрировано нарушение взаимодействия и колокализации-в, присутствии пептида или короткой изоформы (Tu et al., 1998). Такой комплекс IP3R-Homer-mGluR имеет важное физиологическое значение, поскольку экспрессия мутантного Homer, неспособного к образованию олигомеров, приводила к уменьшению в кальциевом выбросе в ответ на активацию mGluR. Аналогично оверэкспрессия Homer la уменьшала изменение внутриклеточной концентрации кальция в ответ на стимуляцию mGluR5 DHPG (Kammermeier and Worley, 2007).
Оверэкспрессия длинной изоформы Homer lbc увеличивала внутриклеточные кальциевые выбросы в ответ на стимуляцию mGluR или при добавлении IP3-AM (эти выбросы блокировались ингибитором IP3R) (Tanaka et al., 2006). В этих клетках также была увеличена частота спонтанных кальциевых всплесков. Эти данные позволяют предположить, что Homer 1с увеличивал выброс кальция через IP3R при его активации 1Р3, хотя нельзя исключить, что здесь Homer влияет на активность RyR, выброс через которые запускается IP3R. Более того, авторы не отслеживали уровень экспрессии белков IP3R, а увеличение выброса кальция может быть связано с изменениями в уровне экспрессии белков. Интересно, что оверэкспрессия белков с мутацией в домене EVH или Homer la не приводила к каким-либо отличиям от контрольных клеток, что противоречит результатам Tu и соавторов, а также Kammermeier и Worley.
В мышиных клетках Пуркинье белок PLCß4 был локализован совместно с IP3RI и mGluRl, в том числе и в дендритах (Nakamura et al., 2004). Также PLCß4 коиммунопрецепитировала IP3R1, mGluRl и Homer 1. Возможно, что белки Homer и организуют этот фосфоинозитидный комплекс.
С-конец PLCß3, но не других изоформ PLCß, взаимодействовал с белком Shank2 (Hwang et al., 2005). В присутствии Shank2 белок Homer образовывал комплекс с фосфолипазой С. Пептид, соответствующий С-концу PLC, значительно уменьшал внутриклеточный кальциевый ответ, запущенный mGluR, поэтому можно заключить что взаимодействие Homer с PLC, опосредованное белком Shank2, необходимо для передачи сигнала от mGluR.