РНК-интерференция в клетках человека, инфицированных рекомбинантным лентивирусом in vitro

• Автор: Головин, Евгений Владимирович
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 81 с. : 26 ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение
Глава 1. Современное состояние исследования клеток, инфицированных ретровирусами, и примененния РНК-интерференции (обзор литературы)

1.1 Современные представления о процессах, происходящих в клетках

человека, инфицированных лентивирусами

1.2 Антиретровирусная терапия

1.3 РНК-интерференция

1.4 Моделирование инфекционного процесса

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1 Общие сведения о работе

2.2 Разработка, оценка специфичности последовательностей и синтез
коротких интерферирующих РНК
2.3 Культивирование клеток человека
2.4 Получение рекомбинантного лентивируса
2.5 Приготовление растворов антиретровирусных препаратов
2.6 Электропорация клеток человека генетическими агентами
2.7 Трансфекция клеток человека малыми генетическими агентами с
применением трансфекционного агента
2.8 Трансдукция клеток рекомбинантным лентивирусом
2.9 Выделение общей РНК для ПЦР-РВ
2.10 Приготовление дуплексов киРНК
2.11 Полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР-РВ)
2.12 Оценка жизнеспособности клеток
2.13 Статистическая обработка данных и графическое представление результатов

Глава 3. Результаты собственных исследований
3.1. Подавление экспрессии минорных белков человека HMGA-1, INI-1, PML, участвующих во внутриклеточном цикле ВИЧ
Белки клетки-хозяина, задействованные в репликации лентивирусов.
Опытные препараты киРНК и оценка их специфичности
Оценка экспрессии генов-мишеней
Жизнеспособность клеточной культуры HeLa
3.2. Разработка клеточной модели ретровирусной инфекции
Получение рекомбинантного ретровируса
Определение инфекционных свойств полученного лентивируса в
серийных разведениях
Определение антиретровирусной активности лекарственных
препаратов с применением рекомбинантного лентивируса
3.3. Антиретровирусный эффект коротких интерферирующих РНК, специфичных к клеточным белкам HMGA-1, INI-1, PML
3.4. Устойчивость геномной и матричной РНК лентивирусов к деградации системой РНК-интерференции
Заключение
Выводы
Благодарности
Список литературы
Приложение А
Приложение Б

Список терминов, условных обозначений и сокращений АРВТ - антиретровирусная терапия;
ВИЧ-1 - вирус иммунодефицита человека 1 типа;
ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения;
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;
киРНК - короткие интерферирующие РНК (siRNA, short interfering RNA); мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота;
ПЦР - полимеразная цепная реакция;
ПЦР-РВ - ПЦР в реальном времени (real-time PCR);
РНК - рибонуклеиновая кислота;
СПИД - синдром приобретенного иммунодефицита;
трансдукция - перенос генетического материала из одной клетки в другую с помощью вируса, приводит к изменению наследственных свойств клеток-реципиентов, не вызывает инфекционный процесс;
трансфекция - один из ведущих методов генной инженерии, процесс введения нуклеиновой кислоты в клетки человека и животных невирусным методом; ЮНЭЙДС - Объединённая программа Организации Объединённых Наций по ВИЧ/СПИД ( UN AIDS Joint United Nations Programme on HIV/AIDS);
GFP - зеленый флуоресцентный белок {green fluorescentprotein); HEK-293T - культура эмбриональных клеток почки человека, (human embryonic kidney), традиционно применяемая в для продукции лентивирусных векторов;
HeLa - классическая культура клеток человека, полученная из раковой опухоли шейки матки пациентки Генриетты Лаке, традиционно применяемая в клеточной биологии;
in vitro - технология выполнения экспериментов, когда опыты проводятся «в пробирке» — вне живого организма;
in vivo - проведение экспериментов на (или внутри) живой ткани при живом организме.

pCS-COF-ChG-PRE
5‘LTR
Векторная плазмида -псевдовирусная геномная РНК
3T.TR
CMV RRE т CMV hrGFP WPRE
LU SA JL
cPPTtCTS
pMDLgifeRRE
CMV | GAG RRE PA
POL
SDSA
pRSV-rev RSvj- REV
AU3RU
Упаковочная
плазмида -
структурные
белки.
ферменты
кроме белка

2-я упаковочная плазмида только вспомогательный белок REV
pMD.G

CMVW VSV.G

Оболочечная плазмида поверхностный белок
Рисунок 1.11. Вариант векторной, двух упаковочных и оболочечной плазмид для сборки лентивирусного вектора третьего поколения. Рисунок из статьи Y Bai, Y Soda, К Izawa и др. «Effective transduction and stable transgene expression in human blood cells by a third-generation lentiviral vector» опубликованной в журнале «Gene Therapy» в 2003 году [140].
Таким образом, анализ опубликованных на сегодня результатов исследования внутриклеточных процессов, происходящих при инфицировании лентивирусами, показывает, что решение проблем лечения лентивирусных инфекций лежит в области совершенствования, как уже существующих лекарственных препаратов, так и разработки принципиально новых средств, в частности, на основе существующих принципов генетической терапии. Именно генная терапия позволяет принципиально изменить терапевтические возможности, включая, и воздействие на отдельные, принципиально важные для процесса репликации вируса белки человека. Очевидно также и то, что прогресс в этом направлении возможен лишь при наличии удобной и биологически безопасной модели, воспроизводящей отдельные этапы внутриклеточного цикла лентивирусов. Одним из инструментов для решения такого рода задач может стать механизм РНК-интерференции.