Роль кислорода в межклеточном взаимодействии гемопоэтических стволовых и мезенхимальных стромальных клеток in vitro

• Автор: Маслова, Елена Викторовна
• Шифр специальности: 03.03.01, 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 126 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Понятие ниши стволовых клеток

1.2. Факторы микроокружения в нише гемопоэтических стволовых клеток

1.2.1. Клеточные факторы

1.2.2. Неклеточные факторы

1.3. Влияния факторов микроокружения на гемопоэтические клетки in

vitro
1.3.1. Пуповинная кровь, как источник гемопоэтических клеток,
применяемых в клинических и лабораторных исследованиях
1.3.2. Идентификация и функциональная характеристика гемопоэтических
клеток
1.3.3. Методические подходы к культивированию гемопоэтических клеток
1.3.3.1. Гемопоэтические клетки в суспензионной культуре
1.3.3.2. Культивирование гемопоэтических клеток с использованием
стромального подслоя. Источники стромальных клеток
1.3.4. Пониженное содержание кислорода как фактор локального
микроокружения in vitro
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Оборудование, материалы и реактивы
2.1.1. Химические реагенты и материалы
2.1.2. Антитела
2.1.3. Оборудование
2.2. Среды для культивирования клеток
2.2.1. Среда для криоконсервации клеток
2.2.2. Полная среда для культивирования жтММСК
2.2.3. Среда для культивирования пкМНК и сокультивирования пкМНК и 46 жтММСК
2.3. Выделение и культивирование клеток
2.3.1. МНК из пуповинной крови человека
2.3.2. ММСК из стромально-васкулярной фракции жировой ткани человека

2.3.3. Криоконсервация жтММСК
2.3.4. Культивирование клеток при пониженном содержании кислорода
2.3.5. Пассирование жтММСК
2.3.6 Подготовка стромального подслоя для сокультивирования с пкМНК
2.3.7 Первичная культура пкМНК
2.3.8. Культивирование гемопоэтических клеток в полужидкой среде
MethoCult Н4
2.3.9. Совместное культивирование пкМНК и жтММСК
2.4. Схема исследования
2.5. Методы исследования
2.5.1. Микроскопия
2.5.2. Проточная цитофлуориметрия
2.5.3. Иммуноцитохимическое окрашивание клеток
2.5.4. Выявление апоптотических и некротических клеток
2.5.5. Определение жизнеспособности методом Live/Dead
2.5.6. Окрашивание по Гимзе
2.5.7. Выявление КОЕ
2.5.8. Выявление КООБ
2.5.9. Определение количества хемокинов в среде культивирования
2.6. Статистическая обработка результатов
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1 Разработка методических подходов для обогащения мононуклеарной
фракции пкМНК ранними недифференцированными предшественниками гемопоэза
3.1.1. Характеристика исходной популяции пкМНК
3.1.2. Культивирование пкМНК без стромального подслоя
3.1.3. Использование жтММСК в качестве стромального подслоя для
культивирования пкМНК
3.1.4. Экспансия пкМНК в совместной культуре с жтММСК
3.2. Взаимодействие пкМНК с жтММСК при концентрациях кислорода,
близких к тканевым
3.2.1. Динамика прикрепления, жизнеспособность и механизмы клеточной
гибели пкМНК

Морфологическая характеристика пкМНК, с о культивируемых с жтММСК
Субпопуляционный состав неприкрепленных пкМНК после сокультивирования с жтММСК
Выявление КОЕ среди пкМНК после сокультивирования с жтММСК
Хемокиновый профиль монокультур пкМНК и жтММСК в зависимости от концентрации кислорода
Влияние сокультивирования пкМНК и жтММСК при различном содержании кислорода на концентрацию хемокинов в кондиционированной среде
Экспансия гемопоэтических клеток пуповинной крови на подслое из жтММСК при различном содержании кислорода
Культура, образованная адгезирующей фракцией пкМНК: жизнеспособность и морфологическая характеристика
Иммунофенотипический анализ суспензионной фракции клеток, образованной адгезирующей фракцией пкМНК
Колониеобразующая способность суспензионной и адгезированной к подслою жтММСК фракции клеток пкМНК
Выявление клеток, способных формировать области «булыжной мостовой» (КООБ), при совместном культивировании пкМНК с жтММСК
Хемокиновый профиль монокультур пкМНК и жтММСК
Сравнительный анализ продукции хемокинов в культуре, образованной адгезирующей фракцией пкМНК в условиях различного содержания кислорода
ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Монокуль тура SCF, Flt3L, G-CSF, IL-3, IL-6, ВМР-4 Lin CD34+ CD38" клетки ПК 3 дня 1.5 (общее число клеток) 1.5 (КОЕ) Увелич. кол-ва КРКМ Bhatia et al., 1
Монокуль тура ТРО, SCF, Flt3L, IL-6, Stem Regenin 1 CD34+ клетки ПК или мобил изован ной пери фер. крови 3 недель 47 (CD34+) 65 (КОЕ) 17-кратное увелич. кол-ва КРКМ Boitano et al. 2
In vivo исследова ниє Wnt5a кондициониро ванная среда Lin" CD34+ CD38' клетки ПК 2 недели, начиная с 2-3 недели после транспл-ции 3-кратное увелич. уровня приж-я и 1.5-кратное увелич. кол-ва С034+С038" среди транспл-х клеток Murdoch et al., 2
In vivo исследова ниє GSK-3 inhibitor Lin" клетки ПК или МНК мобил изован ной пери фер. крови Начиная со дня транспл-ции 5-кратное увелич. кол-ва СБ34+ клеток среди транспл-х Trowbridg e et al., 2
По данным обзора «Ех vivo expansion of hematopoietic stem cells: mission accomplished?», Takizawa et al., 2011, Swiss Med Wkly. LTC-IC (long-term culture-initiating cells) - клетки, способные длительно поддерживать гемопоэз в культуре; КМ -костный мозг; КОЕ - колониеобразующие единицы; КРКМ -клетки репопулирующие костный мозг; МНК - мононуклеарные клетки; ПК - пуповинная кровь; (32т - (3-2 микроглобулин