Морфофункциональный статус нейтрофилов при взаимодействии с наноразмерными флюорофорами

• Автор: Горшкова, Екатерина Николаевна
• Шифр специальности: 03.03.01
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Нижний Новгород
• Количество страниц: 117 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Взаимодействие наночастиц разного состава с компонентами крови
1.2 Исследования физиологического эффекта апконверсионных наноразмерных флюорофоров в системах in vitro и in vivo
1.3 Применение апконверсионных наночастиц в медико-биологических
исследованиях
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Материалы исследования
2.2 Выделение нейтрофилов
2.3 Инкубация клеток крови с наночастицами
2.4 Оценка жизнеспособности нейтрофилов
2.5 Тест с нитросиним тетразолием
2.6 Исследование активности миелопероксидазы нейтрофилов
2.7 Исследование активности кислой фосфатазы
2.8 Исследование активности щелочной фосфатазы
2.9 Лизосомально-катионный тест
2.10 Определение количества гликогена
2.11 Исследование способности нейтрофилов к СЗЬ-зависимой адгезии
2.12 Исследование нейтрофилов методом атомно-силовой микроскопии в режиме реального времени
2.13 Метод FS-спектроскопии для изучения ригидности мембрано-цитоскелетного комплекса
2.14 Обработка данных, полученных методом атомно-силовой микроскопии
2.15 Статистический анализ данных
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Влияние разных видов апконверсионных наночастиц на жизнеспособность нейтрофилов

3.2 Оценка функционального состояния нейтрофилов после взаимодействия с апконверсионными наночастицами
3.2.1 Исследование изменения цитохимического статуса нейтрофильных гранулоцитов после взаимодействия с апконверсионными наночастицами
3.2.2 Измерение ригидности мембрано-цитоскелетного комплекса нейтрофилов после взаимодействия с АК-НЧ
3.2.3 Исследование морфологических параметров нейтрофилов методом атомносиловой микроскопии
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ
В исследованиях адаптационных резервов организма человека в ответ на воздействие факторов окружающей среды большое внимание уделяется системе неспецифической резистентности. Одним из основных клеточных эффекторов системы неспецифической резистентности являются нейтрофильные гранулоциты (Ярилин A.A., 2010). В последнее время они подвергаются атаке новых видов ксенобиотиков поскольку постоянно синтезируются новые разновидности наноматериалов. Исследование гомеостатических реакций нейтрофилов в ответ на наночастицы является принципиальной задачей. Антропогенная нагрузка может изменять стандартные реакции клеток. Вместе с тем, ослабление реактивности нейтрофилов снижает резистентность организма к инфекционным агентам (Ашкинази В.И., 1998). Активная секреторная и медиаторная
деятельность нейтрофилов способствует реализации цитолитического и цитотоксического действия в отношении опухолей (Абакумова Т.В., 2009). Кроме того, нейтрофильные гранулоциты являются активной категорией клеток, которая служит чувствительным индикатором нарушений гомеостаза (Маянский А.Н., Пикуза О.И., 1993). Поэтому необходимо проводить всестороннее исследование функциональных и структурно-морфологических перестроек клетки для определения физиологического резерва нейтрофилов в условиях присоединения к стандартным гомеостатическим реакциям необходимости отвечать на воздействие ксенобиотиков нового вида.
Установлено, что большинство известных к настоящему времени наноматериалов вызывают срыв гомеостатических реакций и гибель как единичных клеток, так и целых организмов (Lam H.W. и соавт., 2006; Choi H.S. и соавт., 2010; Sohaebuddin S.K. и соавт., 2010). Однако, выявляя интегральный токсический эффект авторы редко фокусируются на оценке функционального резерва единичных клеточных структур. Вместе с тем, задача дифференцирования отдельных, критичных для сохранения жизнеспособности нейтрофила мишеней, как и комплексная оценка нарушения гомеостаза клетки,

концентраций легирующих примесей. Например, О. Ehlert и соавт. (2008) показали, что возможно получение АК-НЧ, излучающих четырьмя разными цветами под действием одного источника возбуждения (980 нм). Многоцветный сигнал можно получать и путем инкапсуляции органических красителей или КТ в кремниевые оболочки, апконверсионная люминесценция в таких НЧ реализуется за счет передачи энергии по механизму FRET от ядер, состоящих из апконверсионных кристаллов, к органическим красителям или КТ, содержащимся в оболочке (Li, Zhang, 2006; Li и соавт., 2008; Zhang, Jiang, 2008).
Некоторые авторы, модифицируя структуру АК-НЧ, использовали их для совмещения двух методов исследования: оптическая визуализация и магнитно-резонансной томографии (MPT) (Hifumi и соавт., 2006; Li и соавт., 2008). Например, J. Zhou и соавт. (2010) использовали Tm3+/Er3+/Yb3+ НЧ, кодопированные NaGdF4. Эффективность применения этой технологии была продемонстрирована на опытах с мышами.
АК-НЧ были успешно применены в качестве контрастного вещества для МРТ в естественных условиях, что позволяет рассматривать АК-НЧ в качестве бифункциональной технологической платформы нового поколения датчиков. Целевая визуализация in vivo оказалась перспективной и в диагностике опухолей, и в доставке лекарств. L. Xiong и соавт. (2009) разработали протокол высококонтрастного биоимиджинга, основанный на АК-НЧ в качестве люминесцентных меток, для целевой визуализации опухолей, как in vivo, так и in vitro. Этот метод основан на применении AK-FT4, меченных апоптоз-индуцирующими RGD-содержащими пептидами, в качестве люминесцентных меток. В режиме 3D-сканирования конфокального микроскопа были получены оптические срезы тканей, на которых видно, что для образцов с применением АК-НЧ не характерна аутофлуоресценция даже при высокой глубине проникновения (~ 600 мкм). Более того, для изображений, полученных с помощью АК-НЧ, характерно высокое соотношение сигнал-шум (~24) между опухолью и окружающими тканями. Эти результаты продемонстрировали, что метод