Влияние генетически детерминированных нарушений гомеостаза внутриклеточного кальция на экспрессию нейрорегуляторных белков NAP-22 и GAP-43 у крыс

• Автор: Антонова, Ольга Сергеевна
• Шифр специальности: 03.03.01
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 154 с. : ил.

Оглавление

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ КАЛЬЦИЯ

1.1.1 Основные принципы передачи Са2+ сигнала

1 Л.2 Са2+ каналы и насосы плазматической мембраны

1 Л.З Са2+ каналы и насосы кальциевых внутриклеточных депо

1Л.4 Са2+-связывающие белки немембранных структур клетки

1Л.5 Двойственная природа Са2+ сигнала

1.2 ДЕФИЦИТ СА2+ В ДИЕТЕ. КАЛЬЦИЕВЫЙ ПАРАДОКС
1.2.1 Связь между содержанием кальция в диете и риском возникновения артериальной гипертензии
1.2.2 Нарушения функции центральной нервной системы при генетически детерминированных нарушениях обмена кальция в клетке
1.3 БЕЛКИ N АР-22 (NEURONAL AXONAL MEMBRANE PROTEIN NAP-22) И GAP-43 (GROWTH ASSOCIATED PROTEIN 43)
1.3.1 Структурные и биохимические свойства белка NAP-
1.3.2 Физиологическая роль белка NAP-
1.3.3 Участие белка NAP-22 в патологических процессах
1.3.4 Структурные и биохимические свойства белка GAP-
1.3.5 Физиологическая роль GAP-
1.3.6 Заболевания, связанные с нарушениями функций белка GAP-43
1.4 СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
1.4.1 Традиционные методы
1.4.2 Методы, позволяющие выделить ДНК и РНК одновременно
1.4.3 Метод магнитной сепарации
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Экспериментальные животные
2.2 Изучение влияния дефицита кальция в питьевой воде на сердечнососудистую систему и процессы формирования структур головного мозга
2.3 Забор материала
2.4 Выделение тотальной мРНК и проведение обратной транскрипции
2.5 Проведение полимеразной цепной реакции
2.6 Выделение синаптосом
2.7 Экстракция белков GAP-43 и NAP-
2.8 Аналитический электрофорез белков в ПААГ
2.9 Метод поверхностного иммуноблоттинга
2.10 Устройства и приборы, использованные в исследовании
2.11 Выделение плазмидной ДНК
2.12 Проведение полимеразной цепной реакции для оценки выхода ДНК в автоматизированном режиме

2.13 Методы математической статистики
2.14 Использованные реактивы
3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1 Влияние нарушений обмена кальция в клетке на уровень артериального давления и некоторые характеристики постнатального развития у крыс линий SHR и WKY
3.2 Влияние дефицита кальция в питьевой воде на некоторые характеристики постнатального развития крыс линий SHR и WKY
3.3 Межлинейные различия и влияние дефицита кальция в диете на количественные и структурные изменения белков NAP-22 и GAP-43 в головном мозге крыс линий WKY и SHR в онтогенезе
3.4 Межлинейные различия и влияние дефицита кальция в диете на уровень синтеза мРНК NAP-22 и GAP-43 в головном мозге крыс линий WKY и SHR в онтогенезе
3.5 Оценка двух принципиальных подходов к разработке системы автоматизированного выделения нуклеиновых кислот
3.6 Влияние дефицита кальция в диете на содержание и уровень агрегированности белка NAP-22 в коре и гиппокампе крыс линий WKY и SHR
4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
4.1 Некоторые физиологические особенности крыс со спонтанной гипертензией
4.2 Экспрессия белков — мажорных субстратов протеинкиназы С при спонтанной гипертензии
4.3 Влияние дефицита экзогенного кальция на уровень синтеза мРНК и посггрансляционные модификации белков NAP-22 и GAP-
5 ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АМРА — альфа-амино-3~гидрокси-5-метил-4-изоксазол-пропионовая кислота ВК каналы — К+-каналы с высокой проводимостью СаМ — кальмодулин
СаМК-Н — кальмодулиновая киназа второго типа
(Са2+)і — концентрация свободных ионов Са2+ в клетке
dNTP — дезоксинуклеозидтрифосфаты
ECL — усиленная хемилюминесценция
SERCA-—ретикулярная Са2+-АТФаза
GuSCN — гуанидин тиоцианат
IP3 — инозитолтрифосфат
LH — лионские гипертензивные крысы
NCXs — Na+/Ca2+ обменники
NMDA — К-метил-О-аспаргат
РМСА — Са2+-АТФаза плазмалеммы
RyR — рианодиновые рецепторы
SHR — крысы со спонтанной гипертензией
SHR-SP — «stroke-prone» линия крыс со спонтанной гипертензией
SOCs — депо-управляемые Са2+ каналы
SPCA— Са2+-АТФаза секреторного пути
TRP -— каналы транзиторного потенциала
WKY — крысы Wistar-Kyoto
АД — артериальное давление
ГМК — гладкомышечные клетки
ДАТД — КДФ-диаллилтартардиамид
ДНаза — дезоксирибонуклеаза
ДТТ — дитиотреитол
кДНК — комплементарная ДНК

Дефекты метаболизма кальция, обнаруженные у генетически гипертензив-ных крыс (Schleiffer, 1992), аналогичны обнаруженным нарушениям при эссен-циальной гипертензии у людей (McCarron, 1989; Sowers et al, 1989). Они включают в себя гиперкальциурию, пониженное содержание ионизированного кальция и повышенную концентрацию паратиреоидного гормона в сыворотке крови. Хотя эпидемиологические исследования показали обратное соотношение между потреблением кальция и уровнем артериального давления, клинические наблюдения показали неоднозначный эффект употребления дополнительного кальция в диете (Cutler and Brittain, 1990; Zemel, 1994). Тем не менее эксперименты на животных однозначно показали антигипертензивный эффект потребления большого количества кальция, и были предложены возможные механизмы, объясняющие, как дополнительный кальций понижает артериальное давление.
Эксперименты на SHR начались в 1980-х годах (McCarron et al, 1981) и показали лечебный эффект дополнительного потребления кальция у молодых SHR. Артериальное давление, измеренное у бодрствующих (систолическое среднее АД методом хвостовой манжетки (tail-cuff)) или анестезированных животных (прямое артериальное измерение среднего АД) было значительно ниже контрольного в зависимости от продолжительности употребления и количества кальция в диете (Pang et al, 1992; Arvola et al, 1993). Понижающий эффект дополнительного кальция составлял 16-24 мм рт. ст. для большинства исследований. Продолжительность дополнительного питания варьировалась от 1 до 39 недель для 4-12 недельных SHR. Сравнивать существующие результаты нелегко, потому что диеты сильно отличаются по минеральному и органическому составу (синтетический, полусинтетический). Например, содержание кальция в контроле может варьироваться от 0,15 (Chang et al, 1990) до 1,2% (Ayachi, 1979). Дополнительный кальций в диете в большинстве экспериментов дается в виде карбоната кальция (содержание кальция 0,8-5%), но некоторые ученые добавляют хлорид кальция в питьевую воду.
Дополнительный кальций также давали крысам сублинии SHR, stroke-