Противоречия морфологического и молекулярно-филогенетического подходов в систематике трипаносоматид

• Автор: Костыгов, Алексей Юрьевич
• Шифр специальности: 03.02.11
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 201 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 История изучения трипаносоматид

1.2 Современное состояние системы трипаносоматид

1.3 Распространение

1.4 Жизненные циклы

1.5 Морфологическая характеристика

1.6 Генетический обмен

1.7 Кризис в систематике трипаносоматид

1.8 Выбор объектов исследования

1.9 Молекулярные маркеры, применяемые в филогенетике трипаносоматид
2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
2.1 Фаунистические сборы
2.2 Лабораторные культуры и архивные препараты
2.3 ПЦР и секвенирование
2.4 Филогенетический анализ
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Характеристика обнаруженных видов цистообразующих трипаносоматид
3.1.1 Результаты
3.1.1 Обсуждение
3.2 ВНзЮсгйЫсйа пнпёагит и В. gerтicola
3.2.1 Морфология клеток на типовых препаратах и в культурах
3.2.2 Филогенетический анализ
3.2.3 Обсуждение
3.3 ЕерФшопаз паЫси1ае
3.3.1 Морфология клеток в исходных изолятах и в культурах
3.3.2 Сравнение последовательностей и филогенетический анализ
3.3.3 Обсуждение
3.4 Цистообразующие трипаносоматиды
3.4.1 Результаты
3.4.2 Обсуждение
3.5 Исследование лабораторных культур
3.5.1 Морфология клеток в культурах
3.5.2 Филогенетический анализ
3.5.3 Обсуждение
3.6 Использование белок-кодирующего гена НБР83
3.6.1 Результаты
3.6.2 Обсуждение
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЯ
Приложение 1 — Использованные последовательности из базы ЦепБапк

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы исследования
Жгутиконосцы семейства Trypanosomatidae издавна привлекают внимание исследователей. В первую очередь это связано с тем, что именно к этой группе относятся важные в медико-ветеринарном отношении паразиты человека и животных Trypanosoma и Leishmania, являющиеся возбудителями таких заболеваний как сонная болезнь, кала-азар, болезнь Чагаса, кожный лейшманиоз и многих других. Также в это семейство входят и жгутиконосцы рода Phytomonas, вызывающие тяжелые заболевания культурных растений (масличной и кокосовой пальм, кофе, маниоки и др.) и наносящие тем самым большой экономический ущерб [Camargo, 1999].
Представители остальных родов этого семейства паразитируют, главным образом, в насекомых. Их способность расти на аксеничных средах и быстро накапливать биомассу привела к тому, что их широко применяют в качестве модельных объектов в цитологических, биохимических и молекулярнобиологических исследованиях. Аксеничные культуры гомоксенных трипаносоматид из насекомых также находят применение в биотехнологической промышленности при производстве эукариотических белков. Кроме того трипаносоматиды рассматриваются как возможное средство биологического контроля над численностью переносчиков опасных болезней [Schaub, 1990]. Все это в значительной степени определяет актуальность настоящего исследования.
Большой интерес представляет паразитическая агрессивность группы и предполагаемая высокая скорость образования новых паразито-хозяинных систем. Так уже описано несколько случаев, когда трипаносоматиды, являющиеся гомоксенными паразитами насекомых, поражали растения, животных и человека [Morsy et al., 1988; Conchon et al., 1989; Dedet et al., 1995; Pacheco et al., 1998; Boisseau-Garsaud et al., 2000; Fiorini et al., 2001, Marin et al., 2007].
Трипаносоматиды обладают рядом особенностей, изучение которых имеет общебиологическое значение. Среди них необычная клеточная органелла
кинетопласт, редактирование РНК, полицистронная транскрипция большинства генов, транс-сплайсинг и другие.
Наряду со всем выше изложенным необходимо отметить, что систематика семейства чрезвычайно консервативна, запутана и ненадежна [Momen, 2001]. Десять общепринятых родов трипаносоматид выделяются на основании наличия у них тех или иных морфотипов клеток, определяемых при помощи светового микроскопа (про-, эпи-, хоано-, трипо-, описто-, эндо- и амастиготы) и количества хозяев, вовлеченных в их жизненный цикл. Бурный расцвет электронно-микроскопических исследований, революционизировавший представления о системе протистов вообще, практически никак не отразился на систематике трипаносоматид, несмотря на то, что было получено значительное количество новых данных.
Между тем новейшие молекулярно-филогенетические исследования трипаносоматид дали результаты, противоречащие традиционным представлениям о систематике этой группы. Так, например, была показана полифилия четырех родов гомоксенных трипаносоматид из насекомых - Crithidia, Herpetomonas, Blastocrithidia и Leptomonas [Merzlyak et al. 2001, Podlipaev et al., 2004]. При этом симбионт-содержащие виды трипаносоматид, относящиеся к трем разным родам оказались филогенетически близкими [Hollar et al., 1998]. Было обнаружено, что два наиболее важных с практической точки зрения вида трипаносом - T.brucei и T.cruzi - разделены значительным генетическим расстоянием, сравнимым с теми, что разделяют любые два из остальных родов трипаносоматид [Hannaert et al., 1998; Hughes, Piontkivska, 2003; Hamilton et al., 2004], а представители рода Endotrypanum на филогенетических деревьях заняли место среди лейшманий [Croan, Ellis, 1996].
Все эти факты порождают закономерные сомнения в обоснованности принятой системы и наводят на мысль о необходимости ее пересмотра. Однако для этого, прежде всего, важно понять, из-за чего возникают противоречия между традиционным морфологическим и сравнительно новым молекулярнофилогенетическим подходами в систематике трипаносоматид, и попытаться их разрешить. Анализу этих вопросов и посвящена настоящая работа.

оболочке и занимающую большую часть внутриядерного пространства. В ядрах зрелых "цист" уже невозможно различить детали [Frolov, Karpov, 1995].
У трипаносоматид, как и у всех прочих кинетопластид, деление ядра осуществляется по типу закрытого, внутриядерного плевромитоза и характеризуется полным отсутствием спирал изо ванных хромосом на всех этапах митоза. ЦОМТы митотического веретена морфологическими методами не выявляются. Ядрышковый материал в процессе деления фрагментируется и тесно прилегает к микротрубочкам веретена, а при вытягивании последнего распределяется между дочерними ядрами [Frolov, Karpov, 1995].
Веретено микротрубочек может иметь разный количественный состав у разных трипаносоматид: менее 20 микротрубочек у некоторых Crithidia, От 20 до 30 у большинства изученных видов трипаносоматид (из родов Blastocrithidia, Wallaceina, Trypanosoma, Leishmania, Endotrypanum), около 60 микротрубочек у некоторых видов лейшманий, и, наконец, около 120 микротрубочек у Т. cruzi. Митотическое веретено у трипаносоматид может быть компактным, когда микротрубочки собраны в один компактный пучок и рыхлым, когда они формируют 2-3 пространственно разобщенных пучка. Первый вариант свойствен жгутиконосцам с промастиготной организацией (Leishmania, Wallaceina, Crithidia и культуральным промастиготам Endotrypanum), а для жгутиконосцев имеющих ундулирующую мембрану (jBlastocrithidia, Trypanosoma) характерен второй [Frolov, Karpov, 1995; Фролов, 2000].
Количество кинетохоров варьирует у различных представителей трипаносоматид от 3 до 10 пар, причем у гомоксенных меньше, чем у гетероксенных [см. обзор: Frolov, Karpov, 1995]. Если у обычных эукариот число кинетохоров соответствует числу хромосом, то у трипаносоматид это правило не действует. Хотя морфологически установить взаимосвязь кинетохоров и деспирализованных хромосом у них невозможно, молекулярно-биологическими методами показано, что реальное количество хромосом у трипаносоматид исчисляется десятками и даже сотнями на ядро (Скарлато и др., 1990; van der Ploeg et al., 1984; 1989). Таким образом, значительная часть генома трипаносоматид распределяется без участия кинетохоров,