Разработка диагностических тест-систем при фасциолезе крупного рогатого скота на основе иммуноферментного анализа

• Автор: Коробов, Артем Игоревич
• Шифр специальности: 03.02.11
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 130 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
1. Введение
2. Обзор литературы
2.1. Иммунологические методы диагностики фасциолеза животных
2.2. Использование дот-ИФА в диагностике фасциолеза
3. Собственные исследования
3.1. Материалы и методы
3.1.1. Получение инвазионного материала и приготовление соматического антигена
3.1.2. Получение гипериммунной сыворотки
3.1.3. Истощение сырого антигена фасциол с помощью аффинной хроматографии
3.1.4. Овоскопическое исследование фекалий крупного рогатого скота, зараженного F. hepatica
3.1.5. Постановка и учет результатов ИФА (ELISA) при фасциолезе крупного рогатого скота
3.1.6. Разработка дот-ИФА (dot-ELISA) при фасциолезе крупного рогатого скота
3.1.7. Статистическая обработка данных
3.2. Результаты исследований:
3.2.1. Результаты исследований по постановке и учету ИФА (ELISA) при
фасциолезе крупного рогатого скота
3.2.2: Результаты исследований по разработке дот-ИФА (dot-ELISA) при фасциолезе крупного рогатого скота

3.2.3. Диагностическая эффективность дот-ИФА и ИФА с истощенным соматическим антигеном из водно-солевого экстракта фасциол
3.2.4. Экстенсивность и интенсивность фасциолезной инвазии при послеубойном обследовании
3.2.5. Результаты копроовоскопичекого исследования и сравнения их с серологическими и данными послеубойной ветеринарно-санитарной экспертизы
4. Обсуждение
5. Практические предложения
6. Заключение
7. Выводы
8. Список литературы
Приложение

1. ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы. Фасциолез крупного рогатого скота — зооноз, который характеризуется течением болезни без проявления специфических симптомов с преимущественным поражением гепатобилиарной системы. Возбудителями являются трематоды Fasciola hepatica и Fasciola gigantica, локализующиеся в имагинальной стадии в желчных ходах печени. Данный биогельминтоз широко распространен на территории РФ. Однако степень его распространения и поражения животных неоднозначна в различных природно-климатических зонах нашей страны (FI.A. Яременко, И.Ф. Кленова,
В.В. Горохов, Н.ГГ. Сорокина, И.А. Молчанов, 2005). На основании научных публикаций (И.Ф. Кленова, H.A. Яременко, В.В. Горохов, У.Г. Тайчинов, А.Н. Воличев, B.C. Любавин, 2002; А.А. Атаев, 1990; М.М. Бочарова, 1996;
Н.И. Кошеваров, 2006; В.В. Репетун, 2004) можно утверждать, что в отдельных регионах до 30 % и более поголовья скота заражены фасциолезом. В связи, с чем фасциолезная инвазия наносит значительный экономический ущерб скотоводству России, экономические потери при этом складываются из сокращения удоев молока, часто снижения его качества, уменьшения привесов и утилизации ценного пищевого продукта - печени.
Актуальность разработки тест-системы для прижизненной диагностики фасциолеза крупного рогатого скота на основе дот-ИФА обусловлена необходимостью создания биологической безопасности среды засчет своевременного выявления больных животных и проведения оздоровительно-профилактических мероприятий в хозяйствах. Существующими же на сегодняшний день копрологическими методами диагностики фасциолез можно диагностировать только через 3-4 месяца после начала инвазии. К этому времени фасциола уже является болезнетворным агентом, который вызывает тяжело протекающий воспалительный процесс в печени, переходящий в хронический гепатит по
две группы овец были триады с интервалом в неделю иммунизированы сырыми антигенами, полученными из экстрактов P. microbothrium и D. hospes, с последующим забором крови. Постановку ELISA с экскреторносекреторными антигенами F. gigantica' осуществляли, как описывал Santiago et ai. (1986), иммуноблоттинга (EITB) - Tsang et al. (1983).
Все фасциолезные животные выделяли яйца F. gigantica в фекалии к 10 неделе после заражения, и яйца не обнаруживали через одну неделю после дегельминтизации. В ELISA достоверно различимый уровень специфических антител наблюдался на 2 неделе после заражения, достигая пика к 12 неделе - моменту дегельминтизации. Падение абсорбции антител оказалось достоверно выраженным только к 4 неделе после химиотерапии. В иммуноблоттинге отмечалось последовательное включение распознавания определенных групп белков разной молекулярной массы фасциолезными сыворотками крови овец, а впоследствии такое же их отключение. В сравнительном иммуноблоттинге ЭС антигенов F. gigantica с сыворотками крови от овец, иммунизированных экстрактами P. microbothrium и D. hospes, получили обширные перекрестные реакции. Более интенсивная перекрестная реактивность наблюдалась с сыворотками крови парамфистоматозных овец, однако 4 полипептида с массой 17 кДа, 21 кДа, 57 кДа и 69 кДа распознавались только сывороткой овец, зараженных F. gigantica. Однако, на наш взгляд, использование сывороток крови иммунизированных овец могло не дать точного иммунологического профиля реальных инвазий, вызываемых P. microbothrium и D. hospes.
I. Ferre, L.M. Ortega-Mora, F.A. Rojo-Vazquez (1997) исследовали
кинетику иммуноглобулинов IgG и IgA против F. hepatica в сыворотке и
желчи в течение субклинической фасциолезной инвазии овец, вызванной
экспериментальным путем. Сывороточная активность
глутаматдегидрогеназы (GLDH) и у-глутамилтрансферазы (GGT)
использовалась в качестве маркеров различных стадий инвазии, указывавших
на клеточный некроз, причиной которого была миграция ювенальных