Оксигенные фототрофные микроорганизмы, ассоциированные с гидроидом Dynamena pumila

• Автор: Кравцова, Татьяна Робертовна
• Шифр специальности: 03.02.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 166 с. : ил.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. ОФМ как компонент эпибионтных сообществ

1.1.1. Эпибионтные ОФМ в ассоциациях с одноклеточными водорослями

1.1.2. Эпибионтные ОФМ в ассоциациях с макрофитами

1.1.3. Эпибионтные ОФМ в ассоциациях с беспозвоночными животными

1.1.4. Эпибионтные ОФМ в ассоциациях с гидроидными полипами

1.2. Характеристика колониального гидроида Dynamena pumila и 22 эпибионтных ОФМ, ассоциированных с ним

1.2Л. Состав эпибионтного сообщества, ассоциированногос гидроидом

D. pumila

1.3. Применение молекулярно-генетических методов в гидробиологии

1.4. Методы молекулярного типирования микроорганизмов

1.4.1. Определение Г-Ц состава молекул
1.4.2. ДНК - ДНК и ДНК — РНК гибридизации
1.4.3. Диагностика микроорганизмов, основанная на ПЦР 35 со специфическими праймерами
1.4.4. Полимеразно-цепная реакция
1.4.5. ДНК фингерпринтинг, различные модификации ПЦР, RLFP
1.4.6. Филогенетический анализ
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Количественный анализ обилия эпибионтных ОФМ
2.2. Выделение ОФМ из ассоциаций с гидроидом D. pumila 45 и их исследование
2.2.1. Условия культивирования изолятов
2.2.2. Световая микроскопия
2.2.3. Трансмиссионная электронная микроскопия
2.2.4. Сканирующая электронная микроскопия
2.3. Молекулярно-генетические методы
2.3.1. Выделение ДНК
2.3.2. Амплификация генов 16S рРНК, межгенного спейсера 51 16S-23S рРНК и части гена 23S рРНК
2.3.3. Амплификация ДНК со специфическими праймерами к гену nifH

2.3.4. Амплификация генов 18S рРНК
2.3.5. Очистка фрагментов ПЦР
2.3.6. Приготовление компетентных клеток бактерии Escherichia coli
2.3.7. Лигирование ДНК
2.3.8. Трансформация клеток Escherichia coli плазмидной ДНК
2.3.9. Селекция трансформированных колоний и выделение плазмидной ДНК
2.3.10. Подготовка плазмидной ДНК для секвенирования
2.3.11. Секвенирование фрагмента плазмидной ДНК
2.3.12. Анализ межгенного спейсера ITSl-5,8-ITS2
2.3.13. Анализ секвенированных нуклеотидных последовательностей 61 и филогенетический анализ
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Пространственно-временная динамика ОФМ, ассоциированных 62 с колониальным гидроидом Dynamena pumila
3.2. Идентификация ОФМ, ассоциированных с колониальным
гидроидом Dynamena pumila
3.2.1. Цианобактерия Synechococcus sp. lDp66E-l
3.2.2. Цианобактерия Leptolyngbya sp. 2Dp86E
3.2.3. Цианобактерия Nostoc sp. 10Dp66E
3.2.4. Молекулярно-филогенетический анализ бактерии Gemmatimonas
3.2.5. Зелёная водоросль Desmodesmus sp. 3Dp86E-l
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ

СОКРАЩЕНИЯ
ОФМ — оксигенные фототрофные микроорганизмы
ЭОФМ - эпибионтные оксигенные фототрофные микроорганизмы
ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота
РНК - рибонуклеиновая кислота
ПЦР - полимеразная цепная реакция
п.н. - пар нуклеотидов
СМ — световая микроскопия
СЭМ - сканирующая электронная микроскопия
ТЭМ - трансмиссионная электронная микроскопия
GenBank - База данных NCBI
NCBI - National Center for Biotechnology Information

экспоненциально растущей культуры замораживали в морозильной камере при -20°С и потом размораживали при одновременном перемешивании на установке Vortex при комнатной температуре в течение 5 мин. Данную процедуру повторяли 3-5 раз. Второй способ подготовки заключался в высушивании образцов при 22-25°С в течение часа, далее образцы растирали в ступке пестиком с добавлением небольшого количества стерильного песка до состояния порошка, затем промывали свежей средой BG-11 и суспендировали в 1 мл буфера Tris ЮтМ, либо в ТЕ (50мМ Tris/HCI, 120 мМ NaCI, 50мМ ЭДТА, 8% сахароза и 5% Triton Х-100, pH 8.0).
Лизис клеток проводили в ходе двух последовательных обработок образцов. При первой обработке добавляли 10 мг/мл лизоцима и инкубировали при температуре +37°С в течение 30-60 мин при перемешивании каждые 5 мин. При второй обработке добавляли 2% раствор SDS (додецилсульфат натрия), инкубировали при температуре +40°С в течение 30-60 мин при постоянном перемешивании каждые 5 мин. К лизированной смеси добавляли охлажденный во льду раствор NaCI до конечной концентрации 1М и выдерживали на ледяной бане в течение 30 мин.
Удаление белков производили двумя последовательными экстракциями фенолом/хлороформом (1:1). К раствору с образцами добавляли 500 мкм фенола, перемешивали на Vortex в течение 1-3 мин и центрифугировали в настольной центрифуге (Eppendorf) в течение 5 мин при 13000 обмин. На последнем этапе к водной фазе образца добавляли 2,5 объема ледяного 96% этанола и инкубировали при -20°С в течение 1-12 часов. Образцы центрифугировали в течение 20 мин, при 13000 об/мин, удаляли супернатант, подсушивали осадок и добавляли к нему 50 мкм буфера ТЕ. Полученный препарат ДНК хранили в морозильной камере при температуре -20°С. Выделение хромосомной ДНК из изолята 1Нр86Е-2 сопровождалось трудностями, связанными с разрушением поверхностных структур. Для преодоления этой проблемы использовали методику выделения ДНК из