Молекулярно-генетические изменения при немелкоклеточном раке легкого.

• Автор: Шикеева, Амуланг Алексеевна
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 82 с. : 24 ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Этиология, классификация, диагностика и лечение НМРЛ

1.2. Молекулярно-генетические изменения при НМРЛ

1.2.1 Структурные изменения

1.2.2 Эпигенетические изменения

1.2.2.1 Аномальное метилирование промоторов генов

1.2.2.2 МикроРНК

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Клинический материал
2.2. Выделение геномной ДНК
2.3. Выделение микроРНК из парафиновых блоков
2.4. Бисульфитная модификация ДНК
2.5. Микросателлитный анализ
2.6. Фрагментный анализ
2.7. Рестрикционный анализ
2.8. Метил-чувствительная полимеразная цепная реакция (МЧ-ПЦР)
2.9. Метил-специфическая ПЦР ( МС-ПЦР)
2.10. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
2.11. Обратная транскрипция
2.12. ПЦР в режиме реального времени (Real time-ПЦР)
2.12.1 Real time-ПЦР для определения мутаций гена EGFR
2.12.2 Real time-ПЦР для определения уровня экспрессии микроРНК
2.13. Секвенирование
2.14. Электрофорез в ПААГ
2.15. Ультратонкое окрашивание нитратом серебра
2.16. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)

2.17. Программное обеспечение
2.18. Статистическая обработка данных
3.1. Аллельные нарушения при НМРЛ
Аллельные нарушения в смежной с опухолью условно-нормальной ткани на — различном расстоянии
3.2. Результаты анализа мутации генов EGFR, KRAS и транслокации гена ALK при НМРЛ
3.3. Результаты аномального метилирования промоторов генов у пациентов с НМРЛ
Эпигенетические изменения в смежной с опухолью условно нормальной ткани на различном расстоянии
3.4. Результаты экспрессии зрелых микроРНК в НМРЛ
Определение уровня экспрессии микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 в смежной условно нормальной ткани на различном расстоянии
3.5. Анализ генетических и эпигенетических изменений в опухолевом окружении
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
FISH - флуоресцентная гибридизация in situ
Real time-ПЦР - полимеразная цепная реакция в режиме реального времени АК - аденокарцинома
АПКРЛ - аденоплоскоклеточный рак легкого
ИФР - интерферон
KPJI - крупноклеточный рак легкого
КТ - компьютерная томография
МН - микросателлитная нестабильность
МРТ - магнитно-резонансная томография
МС-ПЦР - метил-специфическая полимеразная цепная реакция
МЧ-ПЦР - метил-чувствительная полимеразная цепная реакция
МЭ - мукоэпидермоидный рак
НМРЛ - немелкоклеточный рак легкого
НХЗЛ - неспецифические хронические заболевания легких
ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией
ПААГ - полиакриламидный гель
ПГ - потеря гетерозиготности
ПКРЛ - плоскоклеточный рак легкого
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ПЭТ - позитронно-эмиссионная томография
УФ излучение - ультрафиолетовой излучение

чувствительную полимеразную цепную реакцию (МЧ-ПЦР). Рестрикционный анализ проводили следующим образом: ДНК обрабатывали метил-
чувствительной рестриктазой Hpall фирмы «Сибэнзим», РФ, по следующей схеме: к 1500 нг (8 мкл) геномной ДНК добавляли 3 е.а. (1 мкл) фермента и 2 мкл соответствующего 10-кратного буфера, доводили до 20 мкл диет, водой и инкубировали в течение 10-12 часов в термостате при температуре 37°С. Рестриктазу Hpall использовали для анализа метилирования промоторов всех исследуемых генов.
2.8. Метил-чувствительная полимеразная цепная реакция (МЧ-ПЦР).
Метод основан на способности метил-чувствительных рестриктаз гидролизовать ДНК, не содержащую модифицированных оснований, и оставлять негидролизованными участки, содержащие метилцитозин.
При проведении МЧ-ПЦР учитывалось наличие внутренних сайтов узнавания для используемой рестриктазы в амплифицируемом участке, который содержал не менее 3-4 сайтов узнавания для рестриктазы Hpall. В случае модификации цитозинов в метил-цитозин гидролиз ДНК не происходит и продукт ПЦР может быть выявлен в геле. При отсутствии метилирования ДНК полностью гидролизуется и продукт ПЦР не определяется. Для исключения возможной гомозиготной делеции исследуемых генов МЧ-ПЦР проводилась на парных образцах: гидролизованная и негидролизованная ДНК. ПЦР проводили при помощи программируемого термоциклера «Терцик» фирмы «ДНК-технология», РФ, с использованием термофильной ДНК-полимеразы фирмы «СибЭнзим», РФ, по следующей схеме: к 0,1 мкг геномной ДНК добавляли 20-170 мкМ каждого олигопраймера, 200 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата, 1-2 единицы термофильной ДНК-полимеразы, 5 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 50 мМ КС1, 10 мМ трис-НС1 pH 8.4. Оптимальное содержание MgCl2 в буфере подбирали экспериментальным путем для каждой пары используемых праймеров. Затем добавляли 40-60 мкл вазелинового масла, прогревали смесь при 94°С в течение 10 мин. и проводили 35 циклов с параметрами: