Исследование генетических механизмов корегуляции метаболизма азота и фосфора у дрожжей Saccharomyces cerevisiae

• Автор: Савинов, Владимир Александрович
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 129 с. : ил.

Оглавление

Список использованных сокращений
Введение
1. Регуляция экспрессии генов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae в ответ на изменение состава среды (Обзор литературы)
1.1. Регуляция транскрипции у дрожжей
1.1.1. Семейство транскрипционных факторов GATA
1.1.2. Регуляторные некодирующие РНК у дрожжей

1.2. Генетический контроль метаболизма азота и фосфора у
дрожжей
1.2.1. Регуляция метаболизма азота у дрожжей
1.2.2. Регуляция метаболизма фосфора у дрожжей
1.2.3. Взаимодействия метаболических путей в клетке дрожжей
2. Материалы и методы
2.1. Основные обозначения
2.2. Штаммы дрожжей и бактерий
2.3. Плазмиды
2.4. Праймеры
2.5. Среды и условия культивирования штаммов
2.6. Методы
3. Результаты и обсуждение

3.1. Влияние источника азота на экспрессию гена РНОЗ и активность фермента КФ РЬоЗр
3.2. Разработка системы селективного отбора мутантов с нарушенной регуляцией гена РНОЗ
3.3. Получение и анализ мутантов Иге+ у трансформантов УМ954[рТЫ] и [р8Р28]
3.6. Идентификация гена, компенсирующего эффект мутации ЯиЫ
3.7. Определение нуклеотидной последовательности гена Лб'Рб у мутантного штамма 5-УМ954

3.4. Анализ последовательности промотора гена РНОЗ
3.5. Поиск генов, компенсирующих эффект мутаций и %цЬ7

3.8. Выделение плазмид, содержащих фрагменты ДНК,
компенсирующих эффект мутации ууЫ, из генных библиотек 105 дрожжей

4. Заключение
Выводы
Список литературы

Список использованных сокращений
5-РОА - фтороротовая кислота;
АДФ - аденозин-5’-дифосфат;
ак - аминокислота, аминокислотный остаток;
АТФ - аденозин-5’-трифосфат;
АДФ - аденозин-5’-дифосфат;
Г АМК - у-аминомасляная кислота, у-аминобутират;
КФ - кислая фосфатаза;
кКФ - конститутивная кислая фосфатаза;
миРНК - микроРНК;
НАД+ - окисленный никотинамидадениндинуклеотид;
НАД Н - восстановленный никотинамидадениндинуклеотид;
НАДФ+ - окисленный никотинамидадениндинуклеотидфосфат; НАДФН - восстановленный никотинамидадениндинуклеотидфосфат; нкРНК - некодирующая РНК;
ПК - протеинкиназа; пНФ - паранитрофенол; пНФФ - паранитрофенилфосфат; п.о. - пары оснований;
ПЦР - полимеразная цепная реакция;
ПЭГ - полиэтиленгликоль;
рКФ - репрессибельная кислая фосфатаза;
ТАЕ - трис-ацетатный буфер;
ТФ - транскрипционный фактор;
УФ - ультрафиолетовое излучение;
Ф„ - неорганический фосфат;
Ц/ф - центрифугирование;
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота;
С02 и аммония катализирует митохондриальный глицин-декарбоксилазный комплекс, состоящий из субъединиц, кодируемых генами GCV1, GCV2, GCV3, LPD1. Многие вид дрожжей могут использовать цитозин и урацил как хорошие источники азота, но не тимин. Дрожжи S. cerevisiae хорошо растут при наличии в среде цитозина, но не урацила. Деградация цитозина катализируется деаминазой, продуктом гена FCY1, и на выходе дает аммоний и урацил. Последний может расщепляться в три этапа до р-аланина и аммония (Messenguy et al., 2006).
Регуляция экспрессии генов азотного метаболизма. Регуляция генов азотного метаболизма происходит на уровне транскрипции и обычно требует два разных положительных сигнала: во-первых, общий сигнал дерепрессии для генов утилизации неудобных источников азота и, во-вторых, сигнал, специфический для пути утилизации конкретного азотосодержащего субстрата и свидетельствующий о его присутствии в среде. В некоторых системах может отсутствовать второй этап индукции и действовать только общий регулятор, снимающий азотную репрессию. Например, у грибов Aspergillus nldulans и Neurospora crassa это продукты генов агеА и NJT2 соответственно, у S. cerevisiae - продукт гена GLN3. Все эти белки являются транскрипционными факторами GATA-типа, специфически распознающими последовательность дезоксирибонуклеотидов GATA и ее производные (Marzluf, 1997).
У дрожжей за регуляцию генов, чувствительных к NCR, отвечают четыре транскрипционных GATA-фактора: активаторы - Gln3p и
Gat 1 p/Nil 1р, и их антагонисты, репрессоры - Gzf3p/Nil2p и Dal80p/Uga43p, связанные сложной системой взаимоконтроля и авторегуляции (Рис. 4). Главное назначение этой системы, по всей видимости, заключается в том, чтобы обеспечивать правильный баланс между количествами четырех регуляторных белков в клетке при изменении состава среды. Активность этих белков напрямую зависит от типа источника азота в среде и от внутриклеточного количества глутамина - необходимого метаболита для