Разработка молекулярно-генетических подходов для оптимизации промышленно-важных характеристик фитазы Citrobacter freundii

• Автор: Гордеева, Татьяна Леонидовна
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 119 с. : ил.

Список сокращений:
ед — единицы активности фитазы (1 ед соответствует высвобождению
1 рмоль неорганического фосфата за 1 мин)
п.н., т.п.н. - пар нуклеотидов, тысяч пар нуклеотидов
и.о. — нуклеотидные основания
ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ORF — открытая рамка считывания
Ар — ампициллин
Тс - тетрациклин
phyA-O - ген фитазы phyA из штамма Obesumbacterium proteus В6898 phyA-C — ген фитазы phyA из штамма Citrobacter freundii В4090 phyA-OMl - мутантный вариант гена phyA-O
phyA-C(X) - мутантные варианты гена phyA-С, где (X) - обозначения
аррА E.coli - ген фитазы аррА из Е
phyA-Cmut - копии гена phyA-С с различными мутациями
phyA-Cmod - ген фитазы с оптимизированными для экспрессии в P. pastoris
кодонами
PhyA-Cf - фитаза из штамма Citrobacter freundii В4090 PhyA-Ор - фитаза из штамма Obesumbacterium proteus В6898 PhyA-Cf(X) - мутантные варианта фитазы PhyA-Cf, где X - обозначения PhyA-OpMl - мутантный вариант фитазы PhyA-Op NCBI — National Center for Biotechnology Information
ГенБанк - База данных GenBankNCBI

I ВВЕДЕНИЕ
II ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1 ЗНАЧЕНИЕ ФИТАЗ ДЛЯ КОРМОПРОИЗВОДСТВА
2 КЛАССИФИКАЦИЯ И СВОЙСТВА ФИТАЗ
2Л Фитазы семейства кислых гистндиновых фосфатаз
2.1.1 Грибные фитазы
2.1.2 Бактериальные фитазы
2.2 Фитазы семейства пирофосфотаз ф-пропеллерных фитаз)
2.3 Фитазы семейства пурпурных кислых фосфатаз
3 ПРОМЫШЛЕННО ВАЖНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ФИТАЗ
4 ПОДХОДЫ К КОНСТРУИРОВАНИЮ ФЕРМЕНТОВ С УЛУЧШЕННЫМИ ХАРАКТЕРИСТИКАМИ
4.1 Принципы рационального конструирования белков
4.2 Принципы «направленной эволюции»
4.3 Принципы «полурационалыюго» конструирования белков
5 ЭКСПРЕССИЯ ФИТАЗ В РАЗЛИЧНЫХ СИСТЕМАХ
5.1 Экспрессия фитаз в бактериях
5.2 Экспрессия фитаз в грибах
5.3 Экспрессия фитаз в дрожжах
6 МЕТОДЫ СИНТЕЗА ГЕНОВ
III МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1 Среды и условия культивирования
2 Штаммы, плазмиды и олигонуклеотиды
3 Манипуляции с ДНК
4 Конструирование плазмид для экспрессии генов фитаз
5 "Errore-prone" ПЦР, конструирование библиотеки мутантных генов
6 Отбор фитаз с повышенной термостабильностью
7 Сайт-направленный и сайт-направленный насыщающий мутагенез
8 Мутагенез областей K29-G74 и Q104-Q131, конструирование библиотеки мутантных генов
9 Метод синтеза гена phyA-Cfmod из олигонуклеотидов
10 Определение фигазной активности
11 Определение свойств фитаз
12 Анализ аминокислотных последовательностей и мутаций
IV РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1 ПРИМЕНЕНИЕ СТРАТЕГИИ СЛУЧАЙНОГО МУТАГЕНЕЗА ЦЕЛОЙ ДНК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕНОВ ФИТАЗ С. FREUNDIIС ПОВЫШЕННОЙ ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТЬЮ
1.1 Получение генов, кодирующих фитазы C.freundii с повышенной термостабильностью, методом "еггог-ргопе'' ПЦР
1.1.1 Выбор объекта для мутагенеза
/. 1.2 Разработка экспрессионной системы и выбор реципиента
1.1.3 Проведение мутагенеза методом "error-prone"ПЦР
1.1.4 Разработка метода отбора фитаз с повышенной термостабильностью
1.1.5 Отбор фитазы с повышенной термостабильностью
1.1.6 Оценка эффективности метода
1.2. Оценка возможности применения метода ДНК-"шаффлинга" для создания генов фитаз С. freundii с повышенной термостабильностыо
2. ПРИМЕНЕНИЕ СТРАТЕГИИ СФОКУСИРОВАННОГО МУТАГЕНЕЗА ДЛЯ СОЗДАНИЯ ГЕНОВ ФИТАЗ С ПОВЫШЕННОЙ ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТЬЮ И ВЫСОКОЙ УДЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ
2.1 Выбор реципиента и системы экспрессии
2.1.1 Выбор реципиента
2.1.2 Получение рекомбинантных плазмид рРЮ-С и рРЮ-О и штаммов на их основе
2.2 Разработка полурашюнального подхода для получения генов термостабильных фитаз
2 2.1. Получение, клонирование, экспрессия геновphyA-CMl и phyA-ОМ
2.2.2 Определение свойств фитаз PhyA-CfMl и PhyA-OpMl
2.2.2.1 Определение молекулярной массы
2.2.2.2 Сравнение термостабильности
2.2.2.3 Оценка удельной активности

2.2.3 Получение, клонирование и экспрессия генарИуЛ-С1
2.3 Получение генов, кодирующих термостабильные фитазы с увеличенной удельной активностью
2.3. / Получение генов на основе мутагенеза ДНК последовательности рдуА-СМ1
2.3.2 Получение генов на основе мутагенеза ДНК последовательности рИуА-С1
2.3.2.1 Выбор мутаций с помощью программы 1-МШшИ 2
2.3.2.2 Получение, клонирование и экспрессия геноврИуА-С(2-6)
3. РАЗРАБОТКА ЭФФЕКТИВНОГО ПОДХОДА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО МУТАНТНЫЙ ВАРИАНТ ФИТАЗЫ С ОПТИМИЗИРОВАННЫМИ СВОЙСТВАМИ
3.1 Разработка подхода и теоретическое обоснование его эффективности
3.2 Получение гена рИуА-СМЗ в результате применения разработанного подхода
3.3 Анализ аминокислотных замен
4. ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ФИТАЗЫ РНУА-СРМЗ
4.1 Анализ термостабильности
4.2 Определение молекулярной массы и удельной активности
4.3 Определение оптимальной рабочей температуры и pH профиля
4.4 Влияние гликозилирования и pH на термостабильность и фитазную активность
4.5 Определение кинетических характеристик
4.6 Оценка кормовых качеств фитазы РЬуА-СШЗ
5. ЭФФЕКТИВНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА РНУА-СМЗМОО В ДРОЖЖАХ Р. РАКГОША
5.1. Разработка синтетической последовательности гена рЬуА-СтосЗ
5.2 Разработка метода синтеза гена рИуА-Стос!
5.3 Влияние оптимизации кодонов па эффективность экспрессии генарИуА-Стос
5.4 Получение штамма Р. ра.чРнч.ч с повышенной экспрессией гена рЬуЛ-СМЗтоА
5.4 Сравнение фитазных активностей КЖ лучших штаммов после прогрева
V ВЫВОДЫ
VI СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Таблица Ш-2.
Праймеры для проведения сайт-направленного мутагенеза
Ген //Фитаза Амино- кислотная замена* Название праймера Последовательность 5'-3'
phyA-CMJ И PhyA-CfMl 0144Ы D/Nc-pr AAGAAAAAACTAACCCTCT
D/Nc-obr ATT А AAA AG AG G GTTAGTTT
N221А V/Ac-obr ACCAGGTAATGAAGCATTGT
V/Ac-pr ACTCCT GAC AATGCTTC ATTA
03440 G/Dc-obr ATTATCGGGTTGATCGGGTA
G/Dc-pr ACTGGTCGCTACCCGATCAA
phyA-OMl И PhyA-OpMl 0144Ы D/No-obr ATGAAATAGCGGGTTGGCCT
D/No-pr ATCAAGCAGGCCAACCCGCT
N221А V/Ao-obr CATCAAGTGCAGCTTTATT
V/Ao-pr ATGGCAATAAAGCTGCACTT
03440 G/Do-obr TTATCCGGCTGATCGGGTA
G/Do-pr TGGGCGCTACCCGATCAG
phyA-Cl, 2,3, 4, 5,6 И PhyA-Cfl, 2,3,4,5,6 К46Е K/Ec-obr ATTATTGGAGTGAATTCCGTA
K/Ec-pr AAGAGCACCTACGGAATTCACT
К461 K/Ic-obr ATT ATTG G AGT G AAG ATCGT А
K/Ic-pr AAGAGCACCTACGATCTTCACT
К46Б K/Sc-pr AAG AGC ACCTACGT CTTT С ACT
K/Sc-obr ATTATTGGAGTGAAAGACGTA
К4бО K/Dc-pr AAGAGCACCTACGGATTTCACT
K/Dc-obr ATTATTGGAGTGAAATCCGTA
К46К K/Rc-pr AAGAGCACCTACGAGATTCACT
K/Rc-obr ATTATT G G AGT G AAT CT CGTA
К46М K/Mc-pr AAGAGCACCTACGATGTTCACT
K/Mc-obr ATTATT GG AGT G А АС AT CGTA
phyA-C№2 И PhyA-Cf№2 Пул мутантных генов и фитаз Произвольные замены в позициях 144/227/344 G/c-pr ACTGGTCGCTACCCNNTCAA
G/c-obr ATT AT CGGGTTGANN GGGT А
D/c-obr ATTAAAAAGAGGNNNAGTTT
D/c-pr AAGAAAAAACTNNN CCTCT
V/c-obr ACCAGGTAATGAANNATTGT
V/c-pr ACTCCTGACAATNNTTCATTA
phyA-CM2 И PhyA-CfM2 03440 G/Del-obr ATTATCGGGTTGACCGGGTA
G/Del-pr ACTGGTCGCTACCCGGTCAA
phyA-CM3mod И PhyA-CfM3 Р128Б P/Spr TGGCTGGTTTGGCTTCAAA
P/Sobr ATTTGACACTTTGAAGCCAA
У4Ю, К46М D/Mpr TGGT GATAG AGCTCC AACT AT GTTTACT
D/Mobr AGTAAACATAGTTGGAGCTCTATCACCA
- для удобства номера позиций аминокислотных замен указаны по последовательности фитазы АррА E. coli. На основании выравнивания аминокислотных последовательностей равноценные замены были осуществлены для фитаз Citrobacter freundii и Obesumbacterium proteus.