Психрофильные морские светящиеся бактерии Aliivibrio logei: структура lux-оперона и регуляция типа "Quorum sensing"

• Автор: Хрульнова, Светлана Алексеевна
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 77 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Список используемых сокращений

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Психрофильные светящиеся морские бактерии. Белки «холодового шока»

1.2. Системы типа “Quorum Sensing”

1.2.1. LuxI/LuxR -зависимая регуляция биолюминесценции у морских бактерий

1.2.2. Ацил-Ь-гомосерин лактоны (AHL) и их взаимодействие с LuxR-подобными белками

1.2.3. Внутриклеточные факторы регуляции экспрессии генов, входящих в опероны систем QS

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Бактериальные штаммы и плазмиды

2.2.Среды и условия культивирования
2.3. Генно-инженерные методы
2.3.1. Препараты ферментов
2.3.2. Химические реагенты
2.3.3. Методы работы с бактериями
2.3.4. Манипуляции с ДНК
2.3.5. Полимеразная цепная реакция
2.3.6. Определение нуклеотидной последовательности
2.3.7. Мульти-генный анализ
2.3.8. Измерение интенсивности биолюминесценции
2.4. Биохимическое тестирование
2.5. Измерение антибиотикограмм
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Идентификация психрофильных морских светящихся бактерий, изолированных в акваториях Белого, Охотского и Берингова морей.,
3.1.1. Определение рода по гену 16S рРНК и биохимические характеристики изолированных штаммов
3.1.2. Мультигенный анализ
3.1.3. Чувствительность к антибиотикам
3.1.4. Заключение о видовой принадлежности исследуемых штаммов
3.2. Анализ системы QS регуляции экспрессии lux- генов A. logei
3.3.Структура и нуклеотидная последовательность /юс-оперона
A. logei
3.4. Сравнительный анализ структур /гсс-оперонов A. logei и A. salmonicida: природа критической люминесценции у бактерии
A. salmonicida
3.5. Влияние мутации в гене cspA на экспрессию luxCD генов
A. logei в клетках E. coli
3.6. Сшг-биосенсоры для определения интегральной токсичности и детекции АИ в среде
3.6.1. Lux- биосенсоры для определения интегральной токсичности
3.6.2. Lwx-биосенсоры для определения АИ в среде
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
QS - Quorum Sensing система,
АТФ - аденозинтрифосфат,
FMN - флавин мононуклеотид,
FMNH2 - восстановленный FMN,
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота,
РНК - рибонуклеиновая кислота,
сАМР - циклический аденозинмонофосфат,
CRP - белок-репрессор,
AHL - ацил-Ь-гомосерин лактоны,
АИ - аутоиндуктор,
АИ-1 - аутоиндуктор первого типа (N-3-оксогексаноил-лактон L-гомосерина и его производные),
SDS - додецилсульфат натрия,
ПЦР - полимеразная цепная реакция,

ругН pyrH-04-FW ATGASNACBAAYCCWAAACC
PBPRB2966R GAATCGGCATTTTATGGTCACG
гесА recAforfisc TCAAATTGAAAAACAATTTGGTAAAGG
recArevfisc ATCTTATCACCATTGTAGCTGTACC
гроА rpoA-01-F ATGCAGGGTTCTGTDACAG
rpoA-03-R GHGGCCARTTTTCHARRCGC
16S рРНК REV16S salm AGCCGGTTTTGTTTCTGCCCTC
Dirl6S salm CAACCTTGGCAATCTGTGTGAACA
Luxl6SD CGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATG
Luxl5SR TGCAGCCCACTCCCATGGTGTGAC
Сравнение нуклеотидных последовательностей генов проводили с гомологичными последовательностями стандартных (референсных) штаммов A. logei АТСС29985т , A. fischeri АТСС7744т и A. salmonicida NCIMB2265T. Корректировку сиквенсовых хроматограмм и их анализ проводили в программе Vector NTI 9. Сравнение результатов секвенирования и дифференциациию до вида проводили с помощью BLAST. Для построения филогенетических деревьев использовали программу MEGA4.0. Филогенетические деревья строились по методу Neighbor-Joining (Beaz-Hidalgo R., et al.,2010; Saitou N., et al., 1987; Tamura K., et al., 2007).
2.3.8. Измерение интенсивности биолюминесценции.
Измерение интенсивности биолюминесценции суспензии клеток проводили с помощью люминометра "Биотокс-7” и микропланшетного люминометра LM-01T (Immunotech) при комнатной температуре. Суспензию клеток переносили в кювету, расположенную в люминометре непосредственно перед фотоумножителем и регистрировали интенсивность свечения.