Молекулярно-генетические особенности Quorum Sensing систем грамотрицательных бактерий (на модели Serratia) и изучение их роли в регуляции клеточных процессов

• Автор: Зайцева, Юлия Владимировна
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 157 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
I. ВВЕДЕНИЕ
II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Общая характеристика семейства Enterobacteriaceae
2. QS системы типа LuxI-LuxR
2.1. Функционирование QS систем LuxI-LuxR типа на примере Vibrio fischeri
2.2. АГЛ и функционирование LuxI—подобных белков
2.3. Функционирование LuxR-подобных белков
3. Участие QS систем типа LuxI-LuxR в регуляции клеточных процессов
3.1. Синтез антибиотиков
3.2. Регуляция синтеза внеклеточных ферментов
3.3.Сворминг, свимминг и слайдинг
3.4. Биопленки
3.5. Синтез факторов вирулентности
3. б. Ферментация глюкозы
4. QS системы, использующие аутоиндуктор АИ-2 (II тип QS систем)
5. QS системы, использующие аутоиндуктор АИ
6. QS и апоптоз у бактерий
III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Среды и условия культивирования бактерий
2. Штаммы, плазмиды и олигонукпеотиды
3. Определение продукции АГЛ
4. Определение сигнапъных молекул QS систем второго типа
5. Определение АГЛ с помощью тонкослойной хроматографии
6. Количественное определение продукции АГЛ методом жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии (LC-MS/MS)
7. Методы работы с ДНК
8. Трансформация E.coli
9. Электропорация
10. Гибридизация ДНК по Саузерну
11. Гибридизация РНК по Нозерну
12. Получение инсерционных мутантов Serratia proteamaculans 94 методом замены генов
13. Анализ ферментативных активностей
14. Определение способности кпеток бактерий к миграции по поверхности среды
15. Анализ биопленок
16. Определение действия летучих веществ Serratia proteamaculans 94 на фитопатогенные грибы
17. Методика анализа состава бактериальных жирных кислот
18. Метод протеомного анализа
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1. Уточнение идентификации Serratia proteamaculans (с помощью секвенирования генов 16S РНК)

4.2. Определение синтеза сигнальных молекул QS систем двух типов у
Serratia proteamaculans
4.2.1. Определение с помощью различных биосенсоров способности бактерий синтезировать сигнальные молекулы QS систем первого типа N-ацил-гомосеринлактоны
4.2.2. Определение сигнальных молекул QS систем первого типа N-ацил-гомосеринлактонов с использованием тонкослойной хроматографии
4.2.3. Определение синтеза АГЛ с помощью масс-спектрометрического анализа
4.2.4. Определение сигнальных молекул QS систем второго типа (гомологи фуранозил-борат-дпэфира, АИ-2) у S. proteamaculans
4.3. Клонирование и секвенирование генов двух типов QS систем
Serratia proteamaculans
4.3.1. Идентификация, клонирование и изучение особенностей организации генов
QS системы первого типа
4.3.2. Клонирование и секвенирование гена luxS QS системы второго типа
4.4. Получение мутантов с нокаутированными генами QS систем
4.4.1. Получение мутантов с нокаутированными генами синтазы N-ацил-гомосеринлактонов и peifenmopuozo белка
4.4.2. Определение влияния мутаций на синтез АГЛ
4.4.3. Получение мутанта в гене luxS (ген синтазы АИ-2 - подобных сигнальных молекул)
4.5. Изучение транскрипции генов QS системы первого типа в штамме
S. proteamaculans 94 и мутантных штаммах
4.6. Исследование влияния мутации в генах sprl, sprR и luxS на свойства
S. proteamaculans
4.6.1. Синтез внеклеточных ферментов у штамма S. proteamaculans 94 и мутантов
4.6.2. Синтез летучих органических соединений у штамма S. proteamaculans 94 и мутантных штаммов .
4.6.3. Определение способности клеток штамма S. proteamaculans 94 и мутантных штаммов к миграции по поверхности среды
4.6.4. Влияние QS систем первого типа на формирование биопленок у Serratia
4.6.5.Анализ состава бактериальных жирных кислот
4.7.Сравнение протеомных карт клеточных культур S. proteamaculans 94 и мутантов sprl:Gmr и sprR:Gmr
4.8. Влияние нитрофуранов, доноров NO и фенольных соединений растительного происхождения на образование биопленок и QS системы бактерий
4.8.1. Действие нитрофуранов и доноров NO на формирование биопленок
P. aeruginosa PAOl и В. cenocepacia
4.8.2. Действие нитрофуранов и доноров N0 на биосенсоры на основе штаммов Escherichia coli, используемых для определения N-ацил-гомосеринлактонов
4.8.3. Действие фенольных соединений на формирование биопленок
P. aeruginosa РАО 1 и A. tumefaciens С58
V. ОБСУЖДЕНИЕ
VI. ВЫВОДЫ
VII. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
QS - Quorum Sensing
АИ - аутоиндуктор
AFJI - N-ацил-гомосеринлактон
ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота
JIOC - летучие органические соединения
ПКС - программируемая клеточная смерть
п.н., т.п.н. — пар нуклеотидов, тысяч пар нуклеотидов
ПЦР — полимеразная цепная реакция
РНК — рибонуклеиновая кислота
ТСХ — тонкослойная хроматография
ЭДТА — этилендиаминтетрауксусная кислота
GenBank — База данных NCBI
NCBI — National Center for Biotechnology Information
SAM - S-аденолилметионин
X-Gal — 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-(3-0-галактозид
Ар — ампициллин
Cm — хлорамфеникол
Gm — гентамицин
Km — канамицин
Tet — тетрациклин
C4-FJI —N-бутаноил-гомосеринлактон С6-ГЛ — N-гексаноил-гомосеринлактон С8-ГЛ— N-октаноил-гомосеринлактон С12-Г Л— N-додеканоил-гомосеринлактон 3-оксо-С6-ГЛ — М-(3-оксо-гексаноил)-гомосеринлактон 3-оксо-С8-ГЛ — 1М-(3-скео-октаноил)-гомосеринлактсн З-оксо-С 10-Г Л — 1ч1-(3-окео-деканоил)-гомосеринлактон З-оксо-С 12-ГЛ — К1-(3-оксо-додеканоил)-гомосеринлактон 3-гидрокси-С6-Г Л — М-(3-гидрокси-гексаноил)-гомосеринлактон 3-гидрокси-С8-Г Л — К-(3-гидрокси-октаноил)-гомосеринлактон

хромосоме бактерии: гена, кодирующего стабильный токсин, который вызывает гибель клеток, и гена, кодирующего лабильной антитоксин, который противодействует активности токсинов. У E. coli обнаружено семь TA-систем. Среди них одной из наиболее изученных является mazEF система, которая была первой охарактеризована как система, ответственная за бактериальную ПКС [11, 86, 179]. Ген mazFкодирует стабильный цитотоксический белок, a mazE - нестабильное противоядие к белку MazF, быстро разрушаемое АТФ-зависимой ClpAP сериновой протеазой [11]. MazF представляет собой эндорибонуклеазу, которая расщепляет РНК в последовательности АСА в рибосом-независимой манере [285, 286]. До тех пор, пока MazE и MazF экспрессируются совместно, MazE нейтрализует токсичное действие MazF [11]. В стрессовых условиях, которые препятствуют экспрессии mazEF-оперона, MazE разрушается, и в результате более стабильный токсин MazF может свободно действовать и в конечном итоге вызывает гибель клеток и автолиз большей части популяции [11, 113].
mazEF-опосредованный апоптоз - это явление, зависящее от плотности популяции, для которого необходим QS-фактор, названный внеклеточным фактором смерти (extracellular death factor, EDF) [15, 137, 138]. Структурный анализ показал, что EDF представляет собой линейной пентапептид, Asn-Asn-Trp-Asn-Asn. Каждая из пяти аминокислот EDF имеет важное значение для его активности [137]. Было показано, что модуль mazEF, а также Zwf (глюкозо-6-фосфат дегидрогеназа) и протеаза ClpXP, необходимы для синтеза EDF [138]. Существует положительная обратная связь между модулем mazEF и активностью EDF: EDF необходим для активации MazF во всех изученных стрессовых условиях, в то же время активация MazF приводила к увеличению синтеза EDF, что в свою очередь приводило к увеличению гибели клеток. Таким образом, EDF является неотъемлемой частью mazEF системы [138].
Совсем недавно было обнаружено, что QS-фактор EDF принимает участие в функционировании ещё одной TA-системы у E. coli, ChpBl-ChpBK [29]. ChpBK - это токсин, гомологичный MazF, представляет собой сайт-специфичную эндорибонуклеазу, расщепляющую одноцепочечную РНК в АСА, ACG и ACU последовательностях. Было установлено, что сигнальная молекула EDF значительно усиливает эндорибонуклеазную активность обоих белков MazF и ChpBK. EDF также нейтрализует ингибиторное действие антитоксинов MazE на токсин MazF и ChpBI на ChpBK. Кроме того, было установлено прямое сайт-специфическое связывание EDF и MazF. Моделирование связи пептид-белок показало сходные взаимодействия между EDF-MazF и MazE-MazF [29]. Эти данные вызывают большой интерес, так как большинство известных QS-молекул контролируют экспрессию генов на уровне транскрипции, a EDF - на посттранскрипционном уровне.