Интернализация экзогенной ДНК в клетках культуры аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 и ее участие в процессе восстановления активности гена Каспазы-3

• Автор: Рогачёв, Владимир Алексеевич
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 111 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА Г ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1Л История вопроса о мутагенном влиянии экзогенной ДНК

1.2 Пути интернализации экзогенной ДНК в соматическую клетку

1.3. Интеграция в реципиентный геном как путь утилизации

интернализованных в ядерном пространстве фрагментов

экзогенной ДНК

1.3.1. Репарация по механизму гомологичной рекомбинации.

Интеграция фрагментов экзогенной ДНК с использованием механизма гомологичной рекомбинации
1.3.2. Негомологичное объединение концов молекулы ДНК.
Захват фрагментов ДНК
1.4. Базовая концепция, характеризующая воздействие фрагментов экзогенной ДНК на соматическую клетку
1.5. Общеклеточная рекомбиногенная ситуация, возникающая при нарушении систем контроля клеточного цикла (СЬекрошГ). Влияние доступности хроматина на интеграцию фрагментов экзогенной ДНК
1.6. Особенности биологии раковой клетки
' 1.6.1. Характеристика основных свойств неопластической клетки
1.6.1.1. Нарушения регуляции клеточного цикла
1.6.1.2. Изменения морфологии и движения клеток
1.6.1.3. Отсутствие репликативного старения (иммортализация)
1.6.1.4. Изменения регуляции апоптоза
1.6.1.4.1. Рецептор - зависимый апоптоз

1.6.1.4.2. Каспазы
1.6.1.4.3. Митохондриальный путь
1.6.1.4.4. Семейство Вс1-2 протеинов
1.6.1.4.5. Апоптоз и пролиферация
1.6.1.4.6. Фагоцитоз апоптических тел

1.6.1.5. Генетическая нестабильность

Заключение
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Культура клеток МСГ-7. Основные особенности

2.2. Культуры клеток и условия культивирования
2.3. Приготовление ДНК и предшественника
2.4. Обработка клеток фрагментированной ДНК
2.5. Приготовление клеточных экстрактов
2.6. Электрофорез в агарозном геле
2.7. Анализ ДНК в клеточных компартментах
2.8. Выделение ядер и очистка ядерной ДНК
2.9. Праймеры и ПЦР анализ
2.10. Центрифугирование в градиенте плотности №С1

2.11. Выделение и анализ апоптозной ДНК
2.12. Выделение суммарной РНК из культуры клеток
2.13. Секвенирование ПЦР фрагментов
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
, 3.1. Распределение по клеточным компартментам экзогенной ДНК размером 200 - 500 п.н., представляющей пул фрагментов,
( содержащих полный геном человека
3.1.1. Качественные характеристики поведения меченого материала (нативные условия). Экспоненциальная фаза роста клеток в момент добавления ДНК и предшественника
в культуральную среду }
1 3.1.1.1. Цитоплазматическая фракция

3.1.1.2. Внехромосомная фракция
3.1.1.3. Хроматин
3.1.1.4. [а-32Р]с1АТР
3.1.2. Качественные характеристики поведения меченого материала (денатурирующие условия). Экспоненциальная
фаза роста клеток в момент добавлений ДНК в среду
3.1.3. Качественные характеристики поведения меченого материала
(денатурирующие условия). Монослой клеток при добавлении

комплексов циклина Е с Cdk2, и т.д. Вход в митоз, например, обусловлен образованием комплексов Cdkl (другое и более распространенное название - Cdc2) с циклином В (Sherr 1996, Blume-Jenser, Hunter, 2001).
Кроме связывания с циклинами, активность Cdk. регулируется изменениями фосфорилирования их определенных аминокислотных остатков (за такую регуляцию ответственны фосфатазьь Gdc25 и протеинкиназы САК, Weel) и связыванием с так называемыми GKI - ингибиторами Cdk. CKI - группа белков,
т-т - Л' /т/- / л 1 WAFl/ClPl „OKIPI ,
состоящаяиз двух семейств: Представители семейства Cip/Kip (р21 ,р I!
и р57К1Р2) ингибируют различные комплексы Gdk2, ответственные за вход и продвижение no-S фазе. В' меньшей степени, они «подавляют активность комплексов циклин B/Cdc2, ответственных за. вход в: митоз. С другой стороны, они* не ингибируют, а даже активируют комплексы циклин D/Gdk4(6), оперирующие в ранней; G1 фазе.; Члены семейства: Ink4 (pl6INK4a, р 15INK4b, pl8,NK4c, pl9INK4d) непосредственно взаимодействуют с Gdk4(6). При-; этом, - связывая Cdk4(6),

находящиеся.в составе активных комплексов с циклином D-и белками1 Cip/Kip,.они вытесняют белки1 Cip/Kip, направляя их на связывание с Gdk2. Поэтому повышение активности;белков1 Ink4, в частности опухолевого супрессора р 161пк4а вызывает как прямое ингибирование активности* комплексов циклин; D/Cdk4(6); так и непрямое: блокирование комплексов циклин E/Cdk2 и циклин A/Cdk2 (Evar, Vou Sten. 2001). ‘ ' - ' 1
Выход покоящейся клетки.из фазы G0 и вступление-ее в митотический цикл инициируется, различными: внешними* стимулами; так, в первую: очередь, различными*декретируемыми цитокипами, принадлежащими- к; группе факторов
роста. Кроме , этого, для- деления: большинства; типов нормальных клеток
! . ’ . ;
необходимо также и взаимодействие специфических рецепторов клетки
. - ' t - .
интегринов - с определенными белками внеклеточного- матрикса (фибрбнекгином,, . коллагеном и др.): Связывание рецепторов со своими лигандами - ростовыми факторами? и белками внеклеточного матрикса - индуцирует аутофосфорилирование внутриклеточных доменов рецепторов и дальнейшее их взаимодействие со многими сигнальными, белками. Следствием этого является стимуляция пересекающихся сигнальных путей и активация так называемых МАР (Mitogen Activated Protein) киназных каскадов (Hanahan, 2000). Конечные продукты'