Поиск и изучение транспортеров, осуществляющих экскрецию пуриновых соединений у штаммов Bacillus и Escherichia coli

• Автор: Шеремет, Анастасия Сергеевна
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 127 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Цель и задачи работы

Научная новизна и практическая значимость работы

Публикации и апробация работы

Структура и объем работы

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Метаболизм пуринов и его регуляция у Bacillus и E. coli

1.1. Путь биосинтеза пуриновых нуклеотидов de novo

1.2. Регуляция биосинтеза пуриновых нуклеотидов de novo на уровне 19 транскрипции
1.2.1. Репрессия PurR
1.2.2. Терминация транскрипции по механизму гуанин-
зависимого рибопереключателя
1.3. Ретроингибирование ферментов биосинтеза пуринов de novo
1.4. Усвоение пуриновых соединений и их взаимопревращение
1.4.1. Резервный {salvage) путь биосинтеза пуриновых
нуклеотидов
1.4.2. Взаимопревращение пуриновых нуклеотидов
1.4.3. Транспорт внутрь и утилизация пуриновых соединений
2. Экскреция различных соединений из клеток E. coli и В. subtilis
2.1. Экскреция аминокислот из клеток E. coli
2.2. NcpI — белок экскреции пуриновых нукпеозидов у E. coli
2.3. PbuE - белок экскреции пуриновых оснований у В. subtilis
3. Применение пуринов
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Бактериальные штаммы, фаги, плазмиды
2. Методы работы с ДНК

3. Трансформация, трансдукция, электротрансформация, сайт-направленный мутагенез, клонирование in vivo и получение генетических модификаций в хромосоме E. coli
4. Трансформация, трансдукция, и получение немаркированных генетических модификаций в хромосоме штаммов Bacillus
5. Определение минимальных ингибирующих концентраций
6. Определение концентраций пуриновых производных в культуральной среде
7. Проведение ферментаций в пробирках со штаммами-продуцентами E. coli и В. amyloliquefaciens
8. Определение активности ß-галактозидазы РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Поиск и изучение генов, участвующих в экскреции пуриновых нуклеозидов у Bacillus
1.1. Клонирование генов В. subtilis, продукты которых гомологичны белку NepI из E. coli
1.2. Клонирование генарЪиЕ из В. amyloliquefaciens
1.3. Изучение регуляции гена рЬиЕвл в E. coli
1.4. Поиск предпочтительных субстратов для экспортера PbuE
1.5. Изучение влияния повышенной экспрессии рЬиЕвл на экзогенное накопление инозина штаммами E. coli
1.6. Изучение влияния экспрессии рЬиЕвл на накопление инозина и гипоксантина штаммами-продуцентами E. coli
1.7. Изучение влияния повышенной экспрессии рЬиЕвл на накопление инозина и гуанозина штаммом-продуцентом
В. amyloliquefaciens
1.8. Конструирование бесплазмидного штамма-продуцента с повышенной экспрессией pbuE
1.9. Гетерологичная экспрессия пер! в штамме В. amyloliquefaciens
1.10. Влияние экспрессии PbuE и NepI на продукцию AICAr
2. Поиск и изучение новых генов, продукты которых обеспечивают экскрецию пуриновых производных у E. coli
2.1. Поиск и идентификация генов, сообщающих при амплификации устойчивость к ингибирующим концентрациям инозина и гуанозина
2.1.1. Получение коллекции фазмид, обеспечивающих устойчивость к пуриновым нуклеозидам

2.1.2. Идентификация генов, содержащихся на фазмиде Ми_37 и обеспечивающих устойчивость к пуриновым
нуклеозидам
2.1.3. Идентификация генов, содержащихся на фазмиде Ми_15 и обеспечивающих устойчивость к пуриновым
нуклеозидам
2.1.4. Идентификация генов, содержащихся на фазмиде Ми_1 и обеспечивающих устойчивость к пуриновым
нуклеозидам
2.1.5. Изучение фенотипических эффектов делеции и повышенной экспрессии тенау1с1У
2.2. Поиск и изучение генов, сообщающих при амшшфикации устойчивость к аналогам пуринов
2.3. Изучение регуляции экспрессии генов 1еиЕ iygaZH
2.3.1. Анализ регуляторной области генов 1еиЕ и ygaZ на наличие сайтов связывания с белком РигК
2.3.2. Влияние аллельного состояния гена ригК на экспрессию
1еиЕ и ygaZ
2.3.3. Влияние пуриновых нуклеозидов, оснований и аналогов пуринов на экспрессию 1еиЕ и ygaZ
2.3.4. Влияние аллельного состояния гена с1еоО на экспрессию
1еиЕ и ygaZ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

гипоксантин индуцируют аденозиндеаминазу, а инозин и аденозин индуцируют синтез пуриннуклеозидфосфорилазы (Nygaard, 1983).
Аденин у В. subtilis способен сразу же превращаться в гипоксантин за счет действия фермента адениндеаминазы, кодируемой геном ade. У E. coli этот фермент отсутствует. Далее гипоксантин фосфорилируется продуктом гена hpt с образованием ИМФ, который, в свою очередь, может превратиться в ГМФ. Этот биосинтез очень эффективен, скорость роста пуринового ауксотрофа В. subtilis на аденине сопоставима со скоростью роста на гипоксантине. Было показано, что для клеток, содержащих поврежденный фермент аденинфосфорибозилтрансферазу (ген apt) и аденозинфосфорилазу (ген deoD), реакция адениндеаминирования является основной в превращении аденина и аденозина в ГМФ (Saxild and Nygaard, 1987). В дополнение было установлено, что мутанты с нарушенным биосинтезом ИМФ и с поврежденным ферментом адениндеаминазой не способны расти на аденине как единственном источнике пуринов (Endo et dl., 1983). Уровень адениндеаминазы снижается в два раза при совместном присутствии аденина и гуанина в культуральной среде (Nygaard, 1993).
Поступление в клетку и усвоение гуанина, гипоксантина и ксантина связано со специфическим превращением этих соединений в соответствующие нуклеотиды. Все эти основания служат в качестве источников пуринов, но с разной эффективностью. У E. coli имеется две 6-оксипурин-фосфорибозилтрансферазы: гипоксантин- и гуанинфосфорибозилтрансфераза,
кодируемые генами hpt и gtp, соответственно. Оба эти фермента ингибируются ppGpp и ГМФ. Мутанты по двум генам hpt и gtp не способны метаболизировать гипоксантин и гуанин (Nygaard, 1983). Гипоксантин при помощи фосфорибозилтрансферазы переходит в ИМФ, гуанин — в ГМФ, а гипоксантин — в КМФ. Гипоксантинфосфорибозилтрансфераза вовлечена, в основном, в утилизацию гипоксантина. Однако ее активность в отношении гуанина достаточна для синтеза гуаниновых нуклеотидов, но не для общего синтеза пуриновых нуклеотидов. Гуанинфосфорибозилтрансфераза способна утилизировать гуанин, гипоксантин и ксантин и, таким образом, полностью удовлетворять потребности клетки в пуриновых нуклеозидах. В клетках В. subtilis превращение гуанина в ГМФ и гипоксантина в ИМФ осуществляет фермент гуанин-гипоксантинфосфорибозилтрансфераза, кодируемый геном hpt. Для превращения ксантина в КМФ существует специфичный фермент