Генетический анализ устойчивости гороха посевного (Pisum sativum L.) к кадмию

• Автор: Кулаева, Ольга Алексеевна
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 168 с. : ил.

Оглавление
ВВЕДЕНИЕ
Глава 1. Обзор литературы
1.1 Тяжелые металлы в окружающей среде
1.2 Гипераккумуляция тяжелых металлов
1.3 Поглощение, транспорт и распределение кадмия по органам и тканям у высших растений
1.4 Влияние кадмия на растительные организмы
1.5 Механизмы устойчивости растений к кадмию и его аккумуляции
1.5.1 Иммобилизация
1.5.2 Хелатирование органическими кислотами и аминокислотами
1.5.3 Синтез стрессовых белков
1.5.4 Цистеин-богатые пептиды и белки
1.5.5 Синтез металпотионеинов
1.5.6 Синтез фитохелатинов
1.5.7 Переносчики кадмия
1.5.7.1 АТФ—зы тяжелых металлов (НМА)
1.5.7.2 Nramp
1.5.7.3 CDF
1.5.7.4 ZIP
1.5.7.5 ABC
1.5.7.6 САХ
1.5.8 Другие переносчики
1.5.9 Другие белки
1.5.10 Синтез микроРНК
1.5.11 Влияние оксида азота
1.6 Генетический анализ устойчивости растений к кадмию и его аккумуляции
1.6.1 Анализ варьирования признаков устойчивости и аккумуляции к кадмию в природных популяциях
1.6.2 Экспериментальный мутагенез

1.7 Методы борьбы с загрязнением почв тяжелыми металлами
1.8 Заключение
Глава 2. Материалы и методы
2.1 Растительный материал
2.2 Условия вегетации растений
2.3 Условия проведения экспериментов при анализе физиологических параметров роста
2.4 Гибридологический анализ и локализация мутации
2.5 Выделение ДНК
2.6 Выделение РНК
2.7 Проведение реакции обратной транскрипции
2.8 Дизайн праймеров
2.9 Проведение стандартной ПЦР
2.10 Выделение фрагментов ДНК из геля
2.11 Секвенирование ДНК
2.12 Разработка молекулярных маркеров
2.13 ПЦР в реальном времени
2.14 ЭЗАР анализ
2.15 Гистохимический анализ распределения кадмия
2.16 Иммунохимический анализ влияния хлорида кадмия на организацию элементов цитоскелета
2.17 Гистохимический анализ влияния хлорида кадмия на отложения суберина
2.18 Статистическая обработка результатов
Глава 3. Результаты исследований
3.1 Морфологический анализ мутанта ЗОЕСб'и исходной линии ЗОЕ
3.1.1 Гистохимический анализ распределения кадмия в кончиках корней у исходной линии и мутанта ЕвЕСФ
3.1.2 Исследование влияния хлорида кадмия на организацию и функционирование тубулиновых микротрубочек у исходной линии ЗОЕ и мутанта ЕйЕСФ
3.2 Анализ физиологических параметров роста мутанта ЗОЕСб' и исходной линии ЭвЕ
3.2.1 Анализ влияния различных концентраций хлорида кадмия на ростовые параметры корней и побегов растений исходной линии ЕОЕ и мутанта ЗОЕСс!

3.2.2 Анализ изменения скорости роста корней и изменения массы корней и побегов исходной линии БйЕ и мутанта ЗОЕСс/ в зависимости от различных концентраций
хлорида кадмия и возраста растений
3.2.3 Анализ содержания кадмия в корнях, побегах и семенах у исходной линии SGE и мутанта SGECd, выращенных в различных условиях
3.3 Анализ защитных реакций исходной линии SGE и SGECd', возникающих при действии различных концентраций хлорида кадмия
3.3.1 Исследование влияния хлорида кадмия на распределение суберина в кончиках корнейу исходной линии SGE и мутанта SGECd
3.3.2 Анализ экспрессии основных переносчиков кадмия
3.3.3 Анализ экспрессии генов, кодирующих фенилапанин-аммопий-пиазу
3.4 Локализация мутации cdt на генетической карте гороха, выявление вероятного гена-кандидата на роль cdt
3.4.1 Первичная локализация мутации cdt с использованием SSAP анализа
3.4.2 Локализация мутации cdt с использованием молекулярных маркеров, разработанных на основе последовательностей известных генов гороха
3.4.3 Локализация мутации cdt с использованием молекулярных маркеров, разработанных на основе анализа экспрессионных профилей A. thaliana и геномной синтении между P. sativum и М. truncatula
3.4.4 Точная локализация мутации cdt на основе анализа геномной микросинтении между P. sativum и М. truncatula
Глава 4. Обсуждение результатов
Заключение
ВЫВОДЫ
Список литературы

из вакуоли (Рисунок 7) (Thomine et al., 2003). Экспрессия AtNRAMPö в дрожжевых клетках приводит к повышенной чувствительности к кадмию, при этом количество кадмия остается неизменным. У растения A.thaliana со сверхэкспрессией AtNRAMPö также наблюдалась повышенная чувствительность к кадмию, однако изменения количества данного тяжелого металла не происходило. Предполагается, что AtNRAMPö кодирует внутриклеточный переносчик кадмия, влияющий на доступность данного тяжелого металла (Cailliatte et al., 2009). У гипераккумулятора N. caerulescens был выявлен повышенный уровень экспрессии генов TcNramp3 и TcNramp4 по сравнению с генами AtNramp3 и AtNramp4 (Oomen et al., 2009). TcNramp3 и TcNramp4 присутствовали в единичной копии они у родственных видов Т. minimum и Т. praecox, в то время как у Т. perfoliatum - в двух копиях, а у Г. japonicum были выявлено несколько копий этих генов По всей видимости повышенный уровень экспрессии TcNramp3 и TcNramp4, по сравнению с А. thaliana, связан с различиями в цис- или трансрегуляторных элементах (Oomen et al., 2009).
1.5.7.3 CDF
CDF (cation diffusion facilitator) семейство участвует в транспорте
цинка, кадмия и кобальта. Белки данного семейства содержат
трансмембранных доменов, катион-связывающий домен на С-конце, а также
гистидин-богатый домен, вероятно участвующий в связи с цинком между 4-
м и 5-м трансмембранными доменами (Hall et al., 2003). У A. thaliana гены,
кодирующие CDF белки, были названы ZAT генами, они вовлечены в
перенос цинка в вакуоль, обеспечивая тем самым его гомеостаз (Van der Zaal
et al., 1999). У гипераккумулятора никеля Т. goesingense был выявлен ортолог
ZAT гена A. thaliana — ген TgMTPl. Данный ген кодирует два транскрипта,
один из которых - TgMTPltl подвергается сплайсингу, а второй - TgMTPlt2
- нет. Транскрипты различаются по последовательности гистидин-богатого
домена, что вероятно обеспечивает разную специфичность металлов к этим
переносчикам. Так, TgMTPltl, экспрессируясь в дрожжевых клетках,