Определение и анализ регуляторных районов гена XIST полевки Microtus Rossiaemeridionalis

• Автор: Орищенко, Константин Евгеньевич
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 146 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Механизмы определения пола

1.2. Эволюция половых хромосом

1.3. Инактивация Х-хромосомы у млекопитающих

1.3.1. Центр инактивации (Хіс)

1.3.2. Некодирующие РНК

1.3.3. ГенХ/sl

1.3.4. Механизмы регуляции активности генаХй/

1.3.4.1. Регуляция активности гена Xist в процессе гшпринтированной инактивации Х-хромосомы
1.3.4.2. Регуляторная область гена Xist
1.3.4.3. Участие транскрипционных факторов, ответственных за
плюрипотентность ЭС іоіеток, в регуляции экспрессии гена Xist
1.2.4.4. Rnfl2 - сцепленный с Х-хромосомой активатор инициации инактивации
Х-хромосомы
1.3.4.5. Ген Tsix как ключевой регулятор экспрессии Xist
1.3.4.6. Дополнительные элементы, регулирующие транскрипцию гена Xist.J
1.3.5. Неслучайная инактивация Х-хромосомы
1.3.6. Участие малых ядерных РНК в процессе инактивации Х-хромосомы
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Микробиологические методы работы
2.1.1. Приготовление компетентных клеток E. coli
2.1.2. Трансформация компетентных клеток Д. coli
2.2. Методики работы с рекомбинантной ДНК

2.2.1. Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса
2.2.2. Очистка плазмидной ДНК на колонках QIAGEN-tip
2.2.3. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции
2.2.4. Электрофорез ДНК в агарозном геле
2.2.5. Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей
2.2.6. Субклонирование фрагментов ДНК
2.2.7. Полимеразная цепная реакция
2.2.8. Определение нуклеотидной последовательности ДНК
2.3. Клеточные линии
2.4. Методы работы с клеточными культурами
2.4.1. Состав культуральной среды и условия культивирования
2.4.2. Получение первичной культуры фибробластов легкого
2.4.3. Получение культуры эмбриональных фибробластов
2.4.4. Замораживание клеток
2.4.5. Размораживание клеток
2.5. Получение белковых экстрактов ядер из культуры клеток
2.6. ln vitro футпринтинг с ДНКазой
2.6.1. Приготовление ДНК-проб для футпринтинга
2.6.2. Реакции связывания
2.6.3 Электрофорез в полиакриламидном геле
2.7. Г ель-ретардация
2.8. Иммунопреципитация хроматина
2.8.1. Выделение и фрагментирование хроматина
2.8.2. Приготовление протеин-А-сефарозы
2.8.3. Иммунопреципитация
2.9. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей ДНК
2.10. Получение репортерных конструкций
2.11. Временная трансфекция и измерение активности люциферазы
2.12. Метилирование остатков цитозина в плазмидной ДНК

на краю этого компартмента, а бедные генами и обогащенные повторяющимися последовательностями районы Х-хромосомы формируют его центральную, коровую часть, где также локализуется Хіяі РНК. Это указывает на наличие сайтов связывания ХШ РНК в негенных районах, однако на данный момент такие последовательности не идентифицированы. Формирование транскрипционно неактивного компартмента не зависит от А-повторов и происходит постепенно. Сначала формируется его коровая часть и из неё исключается РНК-полимераза II, транскрипционные факторы и ферменты, необходимые для процессинга мРНК. Затем, по мере того как осуществляется репрессия транскрипции генов, они перемещаются в этот компартмент. Гены, избегающие инактивации, находятся в петлях на периферии территории неактивной Х-хромосомы - рисунок 5.
День 0 День 2 > День
(обогащена H3K27triMe. не содержит РНК-полимеразы П и транс-крипцноннх факторов)
Рисунок 5. Формирование транскрипционно неактивного компартмента в процессе инактивации Х-хромосомы на примере дифференцировки ЭС клеток (Chow, Heard, 2009).
В другой работе были идентифицированы два белка — SATB1 и SATB2, которые необходимы для реорганизации последовательностей ДНК в процессе созревания Т-лимфоцитов и для Ам/-зависимого сайленсинга в трансгенных и опухолевых Т-клетках (Agrelo et al., 2009). Возможно SATB1 и SATB2 также принимают участие в формировании транскрипционно неактивного компартмента в процессе инактивации Х-хромосомы, однако механизмы их действия еще только предстоит исследовать.