Моделирование метаболизма стероидных соединений растений за счет экспрессии кДНК Cypiiai цитохрома Р450scc животного происхождения

• Автор: Бердичевец, Ирина Николаевна
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 166 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Гены, кодирующие цитохром Р450-зависимые монооксигеназы, и их физиологическая роль в функционировании 7 стероидогенных систем животных и растений

1.1 Л Суперсемейство генов цитохромов Р450

1.1.2 Сравнительная характеристика стероидогеиных систем

животных и растений

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Конструирование экспрессионного вектора р(1ВР45(Л для трансформации растений табака
3.2 Получение трансгенных растений табака, экспрессирующих кДНК СУРНА!
3.3 Молекулярно-генетический анализ первичных трансформантов табака
3.3.1 Анализ трансформантов табака методом ПЦР
3.3.2 Анализ трансформантов табака методом блот-гибридизации по Саузерну
3.3.3 Анализ экспрессии кДНК СУРНА! методом ОТ-ПЦР
3.4 Исследование функциональной активности цитохрома Р4503сс в трансгенных растениях табака
3.5 Изучение наследования гетерологичной кДНК СУР 11 А! у репродуктивного потомства трансгенных растений табака поколений
Т,-Т3
3.5.1 Анализ трансформантов табака поколений Т2 и Т3 методом мультиплексной ПЦР
3.6 Фенотипическая характеристика трансгенных растений табака, экспрессирующих кДНК СУР11А1 цитохрома Р4505Сс из коры 100 надпочечников быка
3.7 Иммуноферментное определение прогестерона в трансгенных . растениях табака
3.8 Определение содержания брассиностероидов в трансгенных
растениях табака, несущих кДНК СУР11А1
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
ПРИЛОЖЕНИЯ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
СУР450 цитохром Р450; цитохром Р450-зависимая монооскигеназа
зршо Зргидроксистероиддегидрогеназа/кетостероидизомераза
5ссЛ стероид 5а-редуктаза
ПЭГ полиэтиленгликоль
МЕ8 4-морфолин-этансульфоновая кислота
БАЛ 6-бензиламинопурин
НУК 1-нафтилуксусная кислота
ИУК индолилуксусная кислота
АБК абсцизовая кислота
2,4-0 2,4-дихлорфенокиуксусная кислота
МС (МБ) питательная среда Мурасиге-Скуга
ВБА бычий сывороточный альбумин
трис 14-трис-(гидроксиметил)-аминометан
ЭДТА этилендиаминтетраацетат
дсн додецилсульфат натрия
РНК рибонуклеиновая кислота
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
ПЦР полимеразная цепная реакция
ОТ-ПЦР полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией
сШТР дезоксирибонуклеотиды
358 РНК СаМУ 358 РНК вируса мозаики цветной капусты
поз ген нопалинсинтазы
Ьаг ген фосфинотрицин ацетилтрансферазы
РРТ фосфинотрицин
кДа килодальтон
п.н. пар нуклеотидов
тех тонкослойная хроматография
24Д-БС 24Л-эпибрассиностероиды
ГХ-МС метод газовой хроматографии и масс-спектрометрии

ВВЕДЕНИЕ
Долгое время считалось, что стероидные гормональные системы животных и растений принципиально различны. Только в последнее десятилетие стали накапливаться данные об определённой структурной и функциональной консервативности путей и регуляции синтеза биологически активных стероидных соединений у этих двух важнейших царств живой природы. Установлено, что основные стадии в процессах биосинтеза и метаболизма стероидных гормонов животных и брассиностероидов растений катализируют цитохромы Р450, в обоих системах функционируют такие ферменты, как стероид 5а-редуктаза (5aR) и
Л5-гидроксистероиддегидрогеназа/Д5-Д4-кетостероидизомераза (3ß-HSD).
Однако, несмотря на очевидное сходство процессов стероидогенеза в растениях и животных, между ними существует фундаментальное отличие, заключающееся в том, что в растениях отсутствует ключевой фермент биосинтеза стероидных гормонов животных - митохондриальный цитохром P450scc (cholesterol side chain cleavage enzyme), катализирующий отщепление боковой цепи холестерина с образованием прегненолона, который является предшественником всех стероидных гормонов животных. Хотя присутствие митохондриальных цитохромов у растений до сих пор не доказано, известно, что в митохондриях наперстянки Digitalis sp. происходит превращение холестерина в прегненолон. Более того, недавно в растениях обнаружен ряд стероидных гормонов животных (17-гидроксипрогестерон,
Мутации в гене DET2, приводили к множественным дефектам в светозависимом росте и развитии растений Arabidopsis, которые комплементировались экзогенным брассинолидом [Li et al., 1996]. Исследования по экспрессии рекомбинантного белка DET2 в эмбриональных клетках почки человека показали, что рекомбинантный растительный белок имеет каталитические и функциональные свойства, характерные для человеческой 5aR [Li et al., 1996]. С другой стороны экспрессия кДНК 5aR человека в мутантных det2 растениях Arabidopsis комплементировала det2 мутацию и восстанавливала фенотип дикого типа [Li et al., 1996], что прямо указывало на то, что ген DET2 кодирует ортолог 5aR млекопитающих.
Белок DET2 Arabidopsis на 38-42 % идентичен по аминокислотной последовательности 5aR млекопитающих и содержит 80% абсолютно консервативных аминокислотных остатков, характерных для человеческого белка 5aR [Li et al., 1996]. Недавно из гороха был клонирован ген PsDET2 -гомолог DET2 гена Arabidopsis [Nomura et al., 2004], также гомологичный 5а-редуктазе животных [Nomura et al., 2004].
Подобно тому, как в растениях и животных существуют белки -отортологи 5aR млекопитающих, в растениях существуют . Зр-гидроксистероидцегидрогеназы/кетостероидизомеразы (3PHSD),
обладаюшие функциональной активностью, присущей 3PHSD млекопитающих [Finsterbuch et al., 1999].