Биоразнообразие сульфатредуцирующих бактерий в кислород-содержащих водах Черного и Балтийского морей

• Автор: Корнеева, Валерия Алексеевна
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 178 с. : ил.

Содержание работы
Введение
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
Цели и задачи исследования
Научная новизна работы
Практическая и теоретическая значимость работы
Апробация работы
Обзор литературы
Глава 1. Сульфатредуцирующие бактерии
1.1. История открытия и изучения сульфатредуцирующих бактерий
1.2. Общая характеристика физиологии сульфатредуцирующих бактерий
1.2.1. Аэротолерантность сульфатредуцирующих бактерий
1.3. Филогения сульфатредуцирующих бактерий
1.4. Распространение сульфатредуцирующих бактерий
1.4.1. Сульфатредуцирующие бактерии в морских экосистемах
Глава 2. Обзор основных молекулярно-биологических методов, применяемых в микробной экологии
2.1. Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH)
2.1.1. Принцип метода
2.1.2. Применение метода FISH в исследованиях сообществ СРВ различных местообитаний
2.2. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР)
2.2.1. Применение метода полимеразной цепной реакции в изучении филогенетического разнообразия СРВ в различных сообществах
2.3. Денатурирующий градиентный гель-электрофорез (ДГГЭ)
2.3.1. Применение денатурирующего градиентного гель-электрофореза в изучении
филогенетического разнообразия СРВ в различных сообществах
Глава 3. Черное и Балтийское моря - общая характеристика водной толщи и сообществ СРВ
3.1. Черное море
3.1.1. Исследования сообществ сульфатредуцирующих бактерий в Черном

3.2. Балтийское море
3.2.1. Исследования сообществ сульфатредуцирующих бактерий в Балтийском

Глава 4. Материалы и методы исследования
4.1. Отбор проб морской воды
4.2. Идентификация и определение численности микроорганизмов методом флуоресцентной in situ гибридизации (FISH)

4.2.1. Микроскопический анализ и подсчет клеток, окрашенных ДАФИ и гибридизовавшихся с соответствующими FISH-зондами
4.3. Выделение тотальной ДНК клеток из водных проб
4.4. Детекция СРБ в водной толще с помощью ПЦР
4.4.1. Вложенная ПЦР
4.4.2. Электрофоретическое разделение и визуализация продуктов ПЦР
4.4.3. Определение численности СРБ методом количественной ПЦР
4.5. Анализ участков гена dsrB с использованием денатурирующего градиентного гель-электрофореза (ДГГЭ) с последующим секвенированием
4.5.1. Секвенирование участков гена dsrB с помощью дидезоксинуклеотидного метода
4.5.2. Анализ полученных нуклеотидных последовательностей и построение филогенетических дендрограмм
4.6. Культивирование сульфатредуцирующих бактерий
4.6.1. Выделение накопительных культур сульфатредуцирующих бактерий
4.6.2. Подбор оптимальных условий для роста накопительных культур из аэробной водной толщи Черного моря
4.6.3. Очистка накопительных культур СРБ с целью получения чистых
культур
4.6.4. Культивирование Desulfosporosinus sp
4.6.5. Культивирование Desulfofrigus sp
4.6.6. Изучение способности Desulfofrigus sp. использовать различные
доноры/акцепторы электронов и сбраживать субстраты
4.6.7. Определение оптимума pH для роста Desulfofrigus sp
4.6.8. Кислородный стресс
4.7. Световая и электронная микроскопия клеток СРБ
4.8. Измерение содержания сероводорода в растущих культурах СРБ
4.9. Определение скоростей сульфатредукции радиоизотопным методом
4.9.1. Измерение скоростей сульфатредукции в пробах морской воды
4.9.2. Измерение скоростей сульфатредукции при росте культуры Desulfofrigus sp. на средах с различным содержанием кислорода в газовой фазе
4.10. Определение жирных кислот в клетке
Результаты и обсуждение
Глава 5. Сообщества сульфатредуцирующих бактерий в подповерхностных кислород-содержащих водах Черного моря
5.1. Содержание кислорода, сероводорода и интенсивность сульфатредукции в верхней водной толще Черного моря
5.2. Исследование сообществ СРБ в верхних водных горизонтах Черного моря методом флуоресцентной in situ гибридизации (FISH)

5.2.1. Общая численность прокариот, бактерий и архей в подповерхностных водах Черного моря, определенная с помощью FISH
5.2.2. Филогенетический состав сообществ сульфатредуцирующих бактерий
подповерхностной водной толщи Черного моря, определенный с помощью

5.3. Обнаружение сульфатредуцирующих бактерий в пробах воды из подповерхностной водной толщи Черного моря с помощью ПЦР-анализа генов 16S рРНК и dsrB
5.3.1. Сообщества свободноживущих и ассоциированных с мелкой (<1,2 мкм) взвесью сульфатредуцирующих бактерий
5.3.2. Сообщества сульфатредуцирующих бактерий, ассоциированных с крупной (>1,2 мкм) взвесью
5.3.3. Численность СРВ в подповерхностной водной толще Черного моря, определенная методом количественной ПЦР
5.4. ДГГЭ-анализ по гену dsrB сообществ СРВ подповерхностной водной толщи Черного моря
5.5. Секвенирование и филогенетический анализ последовательностей участков гена dsrB, выделенных и реамплифицированных из отдельных ДГГЭ-полос
5.6. СРВ в накопительных культурах, выделенных из аэробных вод и зоны хемоклина Черного моря
5.6.1. Оптимизация состава питательной среды для роста накопительных культур СРВ из аэробной зоны Черного моря
5.7. Идентификация микроорганизмов в накопительной культуре СРВ, выделенной с глубины 70 м аэробной зоны водной толщи Черного моря
5.8. Идентификация и описание чистой культуры СРВ, выделенной с глубины 30 м аэробной зоны водной толщи Черного моря
5.8.1. Микробиологическое описание культуры Desulfofrigus sp. штамм SrB-
5.8.2. Оптимум температур для роста культуры Desulfofrigus sp. штамм SrB-
5.8.3. Оптимум pH для роста культуры Desulfofrigus sp. штамм SrB-
5.8.4. Изучение способности культуры Desulfofrigus sp. штамм SrB-30 использовать различные доноры/акцепторы электронов, а также сбраживаемые субстраты
5.8.5. Состав жирных кислот в клетках Desulfofrigus sp. штамм SrB-
5.9. Рост выделенной в чистую культуру СРВ Desulfofrigus euxinos штамм SrB-30 в
присутствии различных концентраций кислорода

свет на ранее неизвестные взаимодействия микроорганизмов различных физиологических и филогенетических групп.
2.2. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).
В 1983 г. американским биохимиком Кэри Муллисом был изобретен метод амплификации фрагментов ДНК - полимеразная цепная реакция (ПЦР). Этот метод позволяет добиться значительного увеличения количества отдельных фрагментов ДНК в пробе. Первая публикация о данном методе появилась в журнале Science в 1985 г. [Saiki et al., 1985], а в 1993 г. Кэри Муллис был удостоен за своё изобретение Нобелевской премии в области химии. Изначально метод ПЦР был разработан для повышения скорости и специфичности пренатальной диагностики серповидно-клеточной анемии, но сейчас он очень широко используется как в клинической диагностике, так и в фундаментальных исследованиях во многих областях биологических наук, в том числе, и в экологии микроорганизмов. Метод ПЦР обладает крайне высокой чувствительностью и теоретически позволяет обнаружить в пробе всего одну молекулу ДНК.
В основе метода ПЦР лежит природный процесс репликации молекул ДНК, то есть комплементарного достраивания матричной цепи ДНК, осуществляемого ферментом ДНК-полимеразой. Как и репликация, ПЦР включает в себя три стадии: денатурация двухцепочечной молекулы ДНК, образование коротких двухцепочечных участков с олигонуклеотидными праймерами, которые служат «затравкой» для синтеза ДНК и, собственно, синтез новой цепи ДНК на матричной цепи.
Для проведения ПЦР необходимы:
- два синтетических олигонуклеотида, называемых праймерами (обычно около 20 нуклеотидов длиной), которые фланкируют нужную последовательность-мишень на матричной ДНК;
- ДНК-матрица;
- термостабильная ДНК-полимераза;
- четыре дезоксирибонуклеозидтрифосфата (дНТФ).