Механизмы регуляции экспрессии генов сериновых протеиназ Bacillus pumilus 7P

• Автор: Черёмин, Андрей Михайлович
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 112 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Сигнальные двухкомпонентные системы
1.1 Структурная организация систем сигнальной трансдукции
2. Сигнальная трансдукция в Bacillus subtilis
2.1 Двухкомпонентная система регуляции DegS/DegU
2.2 SpoOA-система фосфопередачи
2.3 Регуляторное взаимодействие систем DegS/U и SpoOA
3. Сериновые протеиназы
3.1 Субтилизиноподобная протеиназа В. pumilus 7Р
3.2 Глутамилэндопептидаза Л. pumilus 7Р
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Штаммы и плазмиды
2. Среды и условия культивирования микроорганизмов
3. Определение протеолитической активности
4. Основные растворы
5. ПЦР-амплификация ДНК
6. Электрофорез ДНК
7. Олигонуклеотиды, используемые в работе
8. Очистка ПЦР продуктов
9. Трансформация клеток Е. coli
10. Скрининг и отбор трансформантов
11. Выделение и очистка рекомбинантных белков
12. Определение концентрации белка
13. Электрофорез белков в ПААТ
14. Транскрипция in vitro
15. Выделение тотальной РНК
16. Реакция удлинения праймера
17. Фосфорилирование белков in vitro
18. Гель-шифт методология
19. Определение (З-галактозидазной активности
20. ПЦР в режиме реального времени
21. Биоинформационный анализ
22. Математическая обработка результатов
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
1. Исследование динамики роста и накопления протеолитической активности сериновых протеиназ в регуляторных мутантах
2. Аннотация промоторных участков генов субтилизиноподобной протеиназы и глутамилэндопептидазы
3. Определение направления транскрипции генов сериновых протеиназ В. pnmilus 7Р
4. Определение стартовых точек транскрипции генов сериновых протеиназ В. pumilus 7Р
5. Амплификация участков промоторной ДНК генов протеиназ
6. Выделение и очистка регуляторных белков DegS, DegU и SpoOA из рекомбинантных штаммов Е. coli

7. Фосфорилирование регуляторного белка DegU с помощью гистидинкиназы
DegS в системе in vitro
8. Взаимодействие между промоторами генов сериновых протеиназ и
регуляторными белками DegU-Р и SpoOA
9. Модификация сайтов связывания промотора с белком DegU-Р в промоторе гена субтилизиноподобной протеиназы
10. Клонирование модифицированных промоторов в экспрессионный вектор..
11. Транскрипционная и трансляционная активность рекомбинантных генов.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

вариабельность температурного оптимума и стабильности 30-60 С. При температуре выше 65 С наступает денатурация белка. Существуют также психрофильные субтилизиноподобные протеиназы, стабильные в интервале 0-40°С, оптимум активности приходится на 20-30°С (Kristjanson et al., 1999). Кинетические параметры (Кт, А.ат, Кп/куат) субтилизиноподобных протеиназ широко варьируются и зависят от природы субстратов (Georgieva, 2006). Активность субтилизиноподобных протеиназ ингибируется DFP и PMSF.
Глутамилэндопептидазы
Клан химотрипсиновых протеиназ разделяют на 3 группы по субстратной специфичности: 1) группа трипсина и трипсиноподобных ферментов,
гидролизующие пептидные связи, образованные карбоксильными группами Arg и Lys; 2) Химотрипсины и химотрипсиноподобные ферменты (также субтилизины клана SB), расщепляющие пептидные связи, образованные аминокислотами Тгр, Tyr, Phe, а также Met и Leu; 3) Эластазы и эластазоподобные ферменты, расщепляющие связи, образованные аминокислотами, с короткими боковыми неполярными цепями. Глутамилэндопептидазы относят к группе химотрипсинов. Они были открыты в 1970-х годах по способности специфически гидролизовать пептидные связи а-карбоксильных групп глутаминовой и аспарагиновой аминокислот (Руденская, 1998; Demidyuk et al., 2004). В начале изучения глутамилэндопептидаз сложилось мнение, что они характерны для патогенных микроорганизмов, т.к. обнаружились в культуральной жидкости стафилококков. Однако в конце 1980-х годов такие ферменты были обнаружены и среди других микроорганизмов - В. intermedius, В. subtilis, В. licheniformis, S. griseus, Actinomyces sp.и др.(Кйабокого et al., 1993; Leshchinskaya et al., 1997; Демидюк с соавт., 1997). К 2011 году охарактеризовано более 100 белков, относящихся к классу глутамилэндопептидаз. Такие ферменты выделены из патогенных микроорганизмов, а также из актиномицетов, стрептомицетов, стафилококков и бацилл (Johnson et al., 2008; Park et al., 2011)