Молекулярно-генетические и фенотипические особенности геновариантов возбудителя холеры Эль Тор, выделенных на территории Российской Федерации

• Автор: Агафонов, Дмитрий Алексеевич
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 136 с. : ил.

СПИСОК ПРИНЯТЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Генетическое разнообразие природных штаммов возбудителя холеры Эль Тор с атипичной структурой генов, связанных с вирулентностью и эпидемическим потенциалом
1.2. Происхождение природных высоконатогенных геновариантов возбудителя холеры Эль Тор

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Бактериальные штаммы, используемые в работе

2.2. Питательные среды и реактивы

2.3. Микробиологические методы:

2.3.1. Культивирование штаммов

2.3.2. Определение продукции термолабильного гемолизина на плотной среде

2.3.3. Определение подвижности, продукции растворимой гемагглютинин/ протеазы и фосфолипазы
2.3.4. Конъюгационные скрещивания донорных и реципиентных штаммов
2.3.5. Определение вирулентности штаммов V. ско1егае
2.4. Биохимические методы:
2.4.1. Оценка продукции холерного токсина иммуноферментным методом ОМЩЫБА
2.4.2. Двумерный электрофорез, изофокусирование, трипсинолиз белков, масс-спектрометрия и идентификация белков
2.5. Молекулярно-генетические методы:
2.5.1. Выделение ДНК, ДНК гибридизация по Саузерну с молекулярным СТ-зондом
2.5.2. Полимеразная цепная реакция с использованием специфичных олигонуклеотидных праймеров

2.5.3. Определение нуклеотидной последовательности различных генов.
ГЛАВА 3. ВЫЯВЛЕНИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПРИРОДНЫХ ГЕНОВАРИАНТОВ VIBRIO CHOLERAE БИОВАРА ЭЛЬ ТОР С ИЗМЕНЕННОЙ СТРУКТУРОЙ ГЕНОВ ПАНДЕМИЧНОСТИ И ПАТОГЕННОСТИ, ВЫДЕЛЕННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
3.1. Сравнительный анализ генетической организации острова пандемичности VSP-II у типичных и генетически измененных штаммов возбудителя текущей пандемии холеры, изолированных на территории РФ.
3.2. Изучение структуры острова патогенности VPI-1 у геновариантов с делецией ряда генов острова пандемичности VSP-II.
ГЛАВА 4. КОНСТРУИРОВАНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ПЦР ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ГЕНОВАРИАНТОВ С РАЗЛИЧНЫМ ЭПИДЕМИЧЕСКИМ ПОТЕНЦИАЛОМ НА ОСНОВЕ РАЗЛИЧИЙ В СТРУКТУРЕ ИХ ОСТРОВА ПАНДЕМИЧНОСТИ VSP-II
4.1. Выбор генов-мишеней и расчет праймеров.
4.2. Подбор оптимальных условий проведения мультиплексной полимеразной цепной реакции.
4.3. Разработка набора реагентов для проведения мультилокусной ПЦР с электрофоретическим учетом результатов для определения эпидемического потенциала генетически измененных штаммов на основе структуры VSP-II.
4.4. Изучение специфичности и эффективности разработанной мультиплексной ПЦР тест-системы.
4.5. Лабораторные испытания разработанной мультилокусной ПЦР тест-системы.
ГЛАВА 5. АЛГОРИТМ РАСШИРЕННОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕНЕТИЧЕСКИ ИЗМЕНЕННЫХ ШТАММОВ VIBRIO CHOLERAE БИОВАРА ЭЛЬ ТОР
5.1. Разработка алгоритма расширенной идентификации генетически измененных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор.
5.2. Оценка эффективности разработанного алгоритма расширенной

идентификации генетически измененных штаммов V. скокгае биовара Эль Тор
ГЛАВА 6. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ ГЕНОВАРИАНТОВ В ПРОЦЕССЕ КОНЪЮГАЦИИ И ИЗУЧЕНИЕ ИХ ФЕНОТИПИЧЕСКИХ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ
6.1. Экспериментальное получение геновариантов возбудителя холеры Эль
Тор, несущих ген с1хВ1 холерных классических вибрионов
6.2. Сравнительный анализ вирулентных свойств реципиентного штамма V. скокгае М818 биовара Эль Тор и рекомбинантов с повышенной экспрессией ключевых и дополнительных факторов вирулентности
6.3. Молекулярно-генетический анализ экспериментально полученных геновариантов V. скокгае биовара Эль Тор с повышенной продукцией СТ
6.4. Сравнительный протеомный анализ реципиентного штамма V. скокгае М818 и экспериментально полученного геноварианта с гиперпродукцией

ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

N16961
M818
M887
M888
M1011
M582
M568
МЬ69
M589
M1297
M1275
M1264
M1299
M1298
M1272
M1266
M1271
Ml 2
M1293
M1294
M1269
M1268
P17644
P17645
P17647
M1326

M1328
M1344
M1345
M1349
M1429
M1430
P18899
Л-3225
JI-3226
Л-4150

K1509
CIRS101
10 20 110 120 130 140 200 210
... I I I I I I ••• I I I I I I I I I I I I I I
AATATATTGAGGTGGTAAACACAAAATTCC CGT TCTATAGTAAAAAACGACAC-AAAAAAATAAAAAAA TTA TTTGTGTTTTTGTTTATGATTGAATAAGTT
AATATATTGAGGTGGTAAACACAAAATTCC CGT TCTATAGTAAAAAACGATACAAAAAAAATAAAAAAA TTA TTTGTGTTTTTGTTTATGATTGAATAAGTT
Рисунок 5. Нуклеотидные последовательности P,cpA типичных и измененных штаммов Vibrio cholerae биовара Эль Тор, изолированных в разные временные периоды на территории Российской Федерации.
Примечание: N16961 и CIRS101 - референс-штаммы V. cholerae биовара Эль Тор, взятые из международной базы данных GenBank.