Новые методы анализа динамики почвенного микробиома, изученной с использованием метагеномных технологий

• Автор: Першина, Елизавета Владимировна
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 117 с. : ил.

Содержание работы
Введение
Цель и задачи исследования
Глава 1. Обзор литературы.
Структура почвенного метагенома и методы ее изучения
Введение
1. Источники почвенной ДНК
2. Пространственная организация почвенного метагенома
3. Биоразнообразие почвенных микробных сообществ как результат воздействия селективных географических и физико-химических факторов среды
4. Влияние засоления на почвенное микробное сообщество
5. Современные филогенетические и таксономические аспекты исследования биоразнообразия
Глава 2. Объекты и методы исследования
1. Отбор почвенных образцов
2. Приготовление препарата почвенной ДНК
2.1. Выделение ДНК из почвы
2.2. Очистка препарата ДНК
3. Проведение количественной ПЦР
4. Секвенирование нуклеотидных последовательностей
5. Обработка результатов секвенирования
6. Анализ нуклеотидных последовательностей ампликонных библиотек
7. Использование статистических крнитериев для оценки достоверности различий средних и дисперсий
Глава 3. Результаты и обсуждение
1. Анализ численности и общих показателей биоразнообразия микробных сообществ
2. Анализ таксономической структуры микробных сообществ в условиях природного почвенного засоления
3. Анализ таксономической структуры микробных сообществ в условиях искусственного почвенного засоления
4. Сравнительный анализ таксономической структуры микробных сообществ в условиях природного и искусственного почвенного засоления
5. Разработка новых подходов для анализа структуры и динамики микробиома
5.1.Выявление экологических групп галофильных, галотолерантных и негалофиль-ных микроорганизмов
5.2. Разработка и использование модели таксономического пространства (ТП) для гена 16Б рРНК
Выводы
Заключение
Список литературы
Благодарности
Введение

Долгое время изучение почвенных микробных сообществ было основано на выделении культур микроорганизмов с последующим изучением их свойств. При этом прямой подсчет клеток микроорганизмов в почве показал, что их число примерно на порядок превышает оценки численности, полученные с использованием методов культивирования (Мишустин и др., 1978). Анализ почвенной ДНК подтвердил наличие в почве большого числа некультивируемых микроорганизмов, доля которых может составлять до 90% от состава сообщества. Доступ к изучению некультивируемых микроорганизмов появился только с внедрением в микробиологическую практику молекулярно-генетических подходов (Rondon et al., 1999). Оказалось, что почвенный метагеном содержит в себе огромный объем генетической информации (в 1 гр почвы может содержаться до 1015 - 1016 п.и. ДНК, что примерно соответствует 109 - 10i0 бактериальным геномам). Качественный анализ таксономического состава почвенного сообщества, проведенный на основе изучения полиморфизма гена 16S рРНК, показал, что число видов микроорганизмов, формирующих микробное сообщество, исчисляется тысячами (Vogel et al., 2009).
Уже сейчас становятся очевидными перспективы применения молекулярногенетических методов в почвенной микробиологии. В первую очередь, это возможность более полного исследования почвенного микробиома, в перспективе включающее изучение свойств не только культивируемых, но и некультивируемых микроорганизмов, определение состава и функций почвенных микробных ассоциаций, выяснение объема и функциональной нагрузки почвенного микробиологического и генетического потенциала.
В начале своего развития исследования почвенного микробиома были ограничены отсутствием эффективных методик секвенирования (Wooley et al., 2010). Используемая в то время стандартная методика секвенирования по Сэнджеру требовала больших временных и материальных затрат (Маниатис и др., 1984). С появлением методов высокопроизводительного секвенирования стало возможным не только полное исследование таксономической структуры почвенного микробиома, но и изучение ее динамики (Lombard et al., 2011). В результате этого появилась

возможность использовать метагеномные данные для решения основных задач почвенной микробиологии, среди которых большое значение имеет определение общих закономерностей в формировании и функционировании микробиомов различных почвенных местообитаний. Для решения данного вопроса требуется проведение микробиологического скрининга почв различных типов, а также осуществление масштабных мониторинговых исследований по изучению динамики микро-биома в ответ на действие того или иного экологического фактора. Данные исследования будут являться фундаментом для использования метагеномных данных на практике. В частности, они могут быть использованы в природоохранной сфере для сохранения природного биоразнообразия микроорганизмов и выявления факторов, нарушающих его структуру. Также данные по структуре почвенного микробиома могут быть востребованы для решения ряда проблем современного земледелия, таких как: ранняя диагностика и профилактика почвенного состояния, поиск новых потенциально плодородных земель, микробиологическая ремедиация почв, оптимизация использования биопрепаратов, создание новых эффективных растительномикробных систем в практике адаптивного земледелия и др.
Технологическая база для проведения данных исследований намного опережает в своем развитии методологическую базу, связанную с разработкой адекватных методов анализа метагеномных данных, которые позволили бы извлекать из них биологически значимую информацию. На данный момент устойчивой тенденцией является применение методов, которые представляют собой синтез методов биоинформатики и традиционных экологических подходов к оценке биоразнообразия (Schloss et al., 2009). Очевидно, что работа со «списками организмов» при проведении масштабных мониторинговых исследований представляет собой практически невыполнимую задачу, поэтому использование данных по структуре метагенома для решения поставленных ранее задач фундаментальной и прикладной почвенной микробиологии будет напрямую зависеть от применения новых аналитических подходов, которые позволили бы упростить процедуру анализа данных по биоразнообразию и извлечь из них биологически значимую информацию. Работы в направлении поиска качественно новых методов обработки результатов метагеномных исследований активно ведутся (Lilburn et al., 2004; Hur et al., 2004, Hughes et al., 2004; Lee et al., 2006). Также наметилась ярко выраженная тенденция к инте-

ских дистанций, построенную при выравнивании последовательностей, представляющих основные бактериальные филы, при помощи метода многомерной статистики PCoA (Principal Component Analysis, Анализ главных компонентов). В результате были получены двухмерные проекции (каждая точка проекции соответствует отдельной последовательности 16S рРНК), которые показали разделение основных бактериальных фил (Рис. 2).
Рисунок 2. Двухмерная проекция таксономического пространства гена 168 рРНК, полученная с использованием метода РСоА и отображение в нем двух последовательностей из фил Рго1еоЬас1епа и Пгтки/е*. Иллюстрация из работы СагпГу и 1Л1Ьигп, 2002.
Стоит подчеркнуть, что данные результаты были получены на основе исследования лишь малой доли последовательностей (порядка 9000 последовательностей). Более того, на рисунке 2 приведена лишь малая часть проанализированных последовательностей, поскольку даже при анализе 9000 последовательностей, представление данных в виде проекции будет неинформативным из-за их значительного перекрывания (что отмечают и сами авторы) (Оагтку Щ а1., 2002).
Следующий ряд работ, который будет описан в данном разделе, имеет в своей основе идею о том, что филогенетические отношения между различными группами микроорганизмов не могут быть в полной мере представлены «на плоскости», в частности с использованием классических дендрограмм. Эта идея не является принципиально новой, поскольку была заявлена еще при разработке данного метода, но, тем не менее до сих пор не получила решения.