Видовой состав бактерий порядка Bacteroidales в микрофлоре кишечника у здоровых людей и характеристика плазмиды, выделенной из B.uniformis

• Автор: Кулагина, Елена Валерьевна
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 137 с. : 10 ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Введение

1.2 Значение бактерий порядка Bacteroidales в микробноценозе кишечника

1.3 Изучение видового состава бактерий порядка Bacteroidales в микрофлоре кишечника

1.4 Плазмиды у бактероидов

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Объекты исследования

2.2 Бактериологические и молекулярно-генетические методы, примененные для изучения видового состава бактерий порядка Bacteroidales
2.2.1 Культуральные методы
2.2.2 Выделение тотальной ДНК из штаммов бактероидов
2.2.3 Рестрикционный анализ амплифицированной рибосомальной ДНК (ARDRA, Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis)
2.2.4 Секвенирование фрагмента гена 16S рРНК
2.3 Молекулярно-биологические и биохимические методы, примененные для выделения и изучения плазмид у бактероидов
2.3.1 Культивирование бактерий
2.3.2 Полимеразная цепная реакция
2.3.3 Обработка ДНК ферментами нуклеинового обмена
2.3.4 Синтез ДНК-олигонуклеотидов
2.3.5 Трансформация бактериальных штаммов
2.3.6 Конъюгация
2.3.7 Выделение плазмидных ДНК
2.3.8 Секвенирование плазмиды
2.3.9 Выделение тотальной РНК
2.3.10 ОТ-ПЦР в режиме реального времени
2.3.11 Определение антибиотикорезистентности методом бумажных дисков и поиск гена tetQ
2.4 Методы биоинформатпкн и компьютерной обработки данных
2.4.1 Методы биоинформатики
2.4.2 Статистическая обработка данных
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Изучение качественного и количественного состава микрофлоры кишечника
3.2. Особенности видового состава представителен порядка Bacteroidales
3.3. Поиск плазмидных ДНК в штаммах бактерий порядка Bacteroidales
3.4 Определение полной нуклеотидной последовательности плазмиды pBUN
3.5 Анализ полной нуклеотидной последовательности плазмиды pBUN
3.6 Поиск открытых рамок считывания плазмиды рВ1Ж24 среди других штаммов бактерий порядка Васіегоібаїеї
3.7 Повторое выделение плазмиды рВ1Ж
3.8 Экспрессия открытых рамок считывания плазмиды рВ1Ж24 в штаммах Васіегоійев уи^аШэ и [’агаЬасТсгоісІеї сііяіаяопія
3.9 Определение чувствительности к антибактериальным препаратам
3.10 Конструирование челночного клонирующего вектора Е.соїі-Васіегоійех
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ:
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение
Актуальность. Дистальные отделы кишечника являются средой обитания для многочисленного и разнообразного сообщества микроорганизмов. Количество бактерий только в одном грамме содержимого толстой кишки достигает 1012 микробных клеток. Преобладающие в количественном отношении в этой экосистеме бактерии принадлежат к порядкам Bacteroidales (тип Bacteroidetes, класс Bacteroidia) и Clostridiales (тип Firmicutes, класс Clostridia) и роду Bifidobacterium (тип Actinobacteria, класс Actinobacteria, порядок Bifidobacteriales) [Hayashi Н. et al., 2002, Qin J. et al., 2010]. К порядку Bacteroidales относятся строго анаэробные неспорообразующие грамотрицательные палочки. Исследования последнего времени показывают, что, колонизируя кишечник, эти бактерии участвуют в метаболизме сложных полисахаридов, модулируют местный иммунный ответ и препятствуют заселению кишечника патогенными микроорганизмами [Xu J. и Gordon J.I., 2003, Martens Е.С. et al., 2009]. С другой стороны, в случае транслокации из кишечника во внутренние, стерильные в норме, среды организма, бактерии этой таксономической группы могут вызывать тяжелые анаэробные инфекции [WexlerH.M., 2007].
Однако, несмотря на доминирующее положение занимаемое бактериями порядка Bacteroidales в кишечнике человека наши представления о их видовом составе остаются ограниченными. Это, в свою очередь, связано с недостаточной информативностью используемых для решения этой задачи конвенциональных микробиологических методов, которые основаны, прежде всего, на изучении относительно небольшого спектра фенотипических свойств бактериальных штаммов, изолируемых из биологического материала [Song Y.et al., 2005].
Активное внедрение молекулярно-генетических методов в практику микробиологических исследований позволило получить новую

Концентрация бактероидов у детей первого месяца жизни составляла порядка 109 КОЕ/г исследуемого материала. Начиная с 4-х месячного возраста их количество уже превышало 10ю КОЕ/г исследуемого материала. У взрослых людей количество бактероидов в кишечнике в норме достигало 10lo-10n КОЕ/г исследуемого материала [Ефимов Б.А. с соавт., 2005].
По данным Li в нормальной микрофлоре кишечника преобладают
В.coprocola, B.uniformis и B.vulgatus [Li М. et al., 2009]. При изучении состава Bacteroides spp у различных людей были выявлены индивидуальные различия в видовом составе этих микроорганизмов [Li М. et al., 2009]. Также было показано, что среди последовательностей 16S рДНК, которые могут быть получены из фекалий обследуемых людей, встречаются последовательности, которые не могут быть отнесены ни к одному из известных видов и представляют собой, по-видимому, новые таксономические единицы бактерий [Wang et al., 2003].
В работе Hopkins M.J. [Hopkins M.J. и Macfarlane G.T., 2002] было показано, что в микрофлоре с высокой частотой и в наибольшем количестве встречаются бактерии вида Prevotella tannerae. Кроме того, в большом количестве (109 КОЕ/г содержимого), однако, с низкой частотой (менее половины обследованных людей), выявляются виды
B.thetaiotaomicron, B.ovatus, B.ditasonis (в настоящее время-Parabacteroid.es distasonis), B.vulgatus и B.fi-agilis. Причем, если общее количество бактероидов остается с возрастом неизменно высоким, то видовое разнообразие увеличивается и у взрослых людей количество выделенных видов больше, чем у детей.
Увеличение количества бактероидов в течение первого года жизни показано и в работе Enck Р. 2009 [Enck Р. et al., 2009]. В работе Suau [Suau A. et al., 1999] с помощью создания и секвенирования библиотек 16S рДНК в кишечнике были найдены виды B.vulgatus, B.caccae, B.merdae