Метаболические аспекты фитосимбиоза аэробных метилотрофных бактерий

• Автор: Федоров, Дмитрий Николаевич
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 123 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Список сокращений
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1. Особенности биологии аэробных метилотрофных бактерий
Глава 2. Физиолого-биохимические основы ассоциации бактерий с растениями
2.1. Типы ассоциации бактерий с растениями
2.2. Косвенное влияние бактерий на рост и развитие растений
2.3. Прямое влияние бактерий на рост и развитие растений 16 Глава 3. Ассоциации аэробных метилотрофых бактерий с растениями
3.1. Биоразнообразие аэробных метилотрофных бактерий, ассоциированных
с растениями
3.2. Ассоциация аэробных метанотрофов с растениями
3.3. Молекулярные механизмы ассоциации метилотрофов с растениями
3.4. Биосинтез цитокининов аэробными метилотрофами
3.5. Биосинтез ауксинов аэробными метилотрофными бактериями
3.6. 1-аминоциклопропан-1-карбоксилатдезаминаза у метилобактерий
3.7. Примеры косвенного влияния метилотрофов на растения
3.8. Метилотрофные бактерии и азотный метаболизм растений
3.9. Влияние метилотрофных бактерий на рост и развитие растений in vivo
3.10. Биосинтез витамина Вп аэробными метилотрофами 43 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 4. Материалы и методы
4.1. Объекты исследований
4.2. Культивирование бактерий
4.3. Молекулярно-биологические методы
4.3.1. Общие методы
4.3.2. Мутагенез
4.3.2. Комплементация мутаций
4.3.3. Создание векторов для сверх-экспрессии рекомбинантных белков
4.3.4. ПЦР-ампилифшкация nifHD-генов различных бактерий
4.3.5. Филогенетический анализ
4.4. Экспрессия и очистка рекомбинантных белков
4.5. Гельпроникающая хроматография
4.6. Нативный Г1ААГ-электрофорез и зимографический анализ

4.7. Определение активностей ферментов
4.8. Выделение и анализ ауксинов
4.9. Эксперимент по влиянию экзогенной ИУК на метаболизм М. extorquens
4.10. Эксперимент по инокуляции гнотобиотических растений
4.11. Определение содержания витамина В12
4.12. Статистическая обработка данных РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 5. Характеристика генов и ферментов биосинтеза ауксинов у метилобактерий
5.1. Поиск генов, кодирующих ферменты биосинтеза ИУК, в геномах представителей рода Methylobacterium
5.2. Очистка и характеристика рекомбинантной
индолил-3-пируватдекарбоксилазы из Methylobacterium extorquens АМГ
5.3. Очистка и характеристика рекомбинантной декарбоксилирующей окислительной дезаминазы ароматических L-аминокислот из Methylobacterium nodulans ORS 2060
5.4. Роль индолил-3-пируватдекарбоксилазы в биосинтезе ИУК у Methylobacterium extorquens
5.5. Влияние различных штаммов Methylobacterium extorquens на рост гнотобиотических растений in vitro.
5.6. Влияние экзогенной ИУК на активность ферментов центрального метаболизма у Methylobacterium extorquens AMI
Глава 6. Ферменты катаболизма 1-аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты и D-цистеина у метилобактерий
6.1. Поиск генов, кодирующих АЦК-дезаминазу и D-цистеиндесульфогидразу в геномах представителей рода Methylobacterium
6.2. Очистка и характеристика рекомбинантной D-цистеиндесульфогидразы из
Methylobacterium extorquens AMI
6.3. Делеция гена D-цистеиндесульфогидразы у Methylobacterium extorquens
6.4. Клонирование и характеристика 1-аминоциклопропан-1-карбоксилатдезаминазы из Methylobacterium radiotolerans JCM2831
Глава 7. Оценка способности метилотрофов к азотфиксации и биосинтезу витамина Bi2
7.1. Разработка системы вырожденных праймеров для амплификации фрагментов генов nifHD
7.2. Содержание витамина Bi2 в клетках ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АГЛ — А-ацилгомосеринлактон
АЦК - 1-аминоциклопропан-1 -карбоновая кислота
АДФ - аденозиндифосфорная кислота
АМФ - аденозинмонофосфорная кислота
АТФ — аденозинтрифосфорная кислота
вкм - Всероссийская Коллекция Микроорганизмов
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография
5,6-ДМБ - 5,6-диметилбензимидазол
ДОФА - 3,4-дигидроксифенилаланин
ДОФАмин - 3,4-дигидроксифенилэтиламин
ден - додецилсульфат натрия
ДХФИФ - дихлорфенолиндофенол
иптг - изопропил-Р-тиогалактопиранозид
ИАА - индолил-3-ацетальдегид
НАМ - индолил-3-ацетамид
ИАН - индолил-3-ацетонитрил
ИБ - индолил-3-бутират (индолил-3-масляная кислота)
ИМК - индолил-3-молочная кислота
ИПвК - индолил-3 -пировиноградная кислота
ИСУ - индуцированная системная устойчивость
ИУК - индолил-3-уксусная кислота
мдг - метанолдегидрогеназа
над+/надн2 - окисленный/восстановленный никотинамиддинук
надф7надфн2 - восстановленный никотинамиддинуклеотидфосфг
ПААГ — полиакриламидный гель
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РБФ - рибулозо-1,5-бисфосфат
РБФК/О - рибулозобисфосфаткарбоксилаза/оксигеназа
РМФ - рибулозомонофосфат
РОФМ - розовоокрашенный факультативный метилотроф
СПУ - системная приобретенная устойчивость
ТАМ - триптамин
ТГФ - тетрагидрофолат
ТПФ - тиаминпирофосфат

et al, 2002b], Methylocella silvestris [Dunfield et al., 2003], Methylocella tundrae [Dedysh et al., 2004], которые доминировали в популяции с численностью 105-106 клеток / г торфа, отличались способностью фиксировать молекулярный азот и расти на бедных минеральных средах.
Итак, исследования показали, что на огромной территории севера России, от Чукотки и Камчатки до Полярного Урала, находящейся в зоне тундры и вечной мерзлоты, работает психрофильный метанокисляющий бактериальный фильтр. Он представляет собой хорошо организованную растительно-микробную систему, по-видимому, способную контролировать поток метана в атмосферу из тундры, причем метанотрофы были обнаружены не только на поверхности, но и в гиалиновом пространстве клеток сфагнума, а также в проводящих сосудах осоки [Vecherskaya et al., 1993, Васильева с соавт., 1999].
3.3. Молекулярные механизмы ассоциации метилотрофов с растениями
В последние годы интенсивно секвенируются геномы различных прокариот, в том числе и метилотрофов. Впервые полная геномная последовательность ДНК у метилотрофов была получена для термотолерантного метанотрофа Methylococcus capsulatus Bath [Ward et al., 2004]. В настоящий момент завершены проекты по секвенированию геномов следующих мстилотрфов: Methylacidiphilum infernorum,
Methylotenera mobilis, Methylibium petroleiphilum, Methylobacillus flagellatus, Methylocella sylvestris, Methylovorus sp. SIP3-4, Xanthobacler autotrophicus Py2 [Hou et al., 2008; Kane et al., 2007; Chistoserdova et al., 2007]. Однако наибольший интерес для исследования фитосимбиоза аэробных метилотрофов представляет проект по секвенированию восьми геномов представителей из рода Methylobacterium: М. extorquens AMI, М. extorquens РА1, М. dichloromethanicum DM4, M. chloromethanicwn CM4, M. nodulans, M. populi, M. radiotolerans, Methylobacterium sp. 4-46 [Vuilleumier et al., 2009].
Первая версия генома M. extorquens AMI позволила провести крайне интересный эксперимент, целью которого являлось сравнение бактериальных протеомов при эпифитной колонизации и при культивировании метилотрофа в минеральной среде. В результате выяснили, что при эпифитном росте бактерий действительно происходит увеличение содержания 45 белков, по сравнению с бактериями, растущими на синтетической среде. Среди белков, индуцированных при эпифитном росте, обнаружены белки утилизации метанола, стрессовые белки, а также белки с неизвестной функцией [Gourion et al., 2006]. Среди этих белков обнаружен регуляторный белок PhyR, проявляющий сходство с о-субъединицами РНК-полимеразы. Делеция в гене phyR